Đồ án tốt nghiệp: Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris

- TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG.
- Môi trường.
- Tạo dòng tế bào E.
- Chuẩn bị tế bào E.
- Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp.
- 3.3.2.Tạo dòng tế bào E.
- coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.
- Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.
- Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E.
- Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa.
- pastoris tái tổ hợp.
- Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn.
- Kiểm tra dòng tế bào E.
- Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI.
- coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD bằng giải trình tự.
- Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD.
- coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2- CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml) ...444.
- Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2-CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi CelDF/ CelDR và sản phẩm cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI.
- Sàng lọc tế bào P.
- Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo.
- Trên cơ sở đó đề tài: “Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành..
- coli DH5𝛼 mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa gen CelD.
- Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D..
- Gen ngoại lai chứa trong plasmid tái tổ hợp có khả năng tích hợp vào hệ gen của P.
- pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương đồng trong bộ gen nấm men.
- DNA tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản sao trong bộ gen tế bào chủ.
- Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His + biến nạp (Thân Văn Minh, 2012)..
- pastoris có khả năng sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp với hàm lượng lên đến gram trên lít..
- coli tái tổ hợp..
- Sau khi được tinh sạch, gen CelD được nối vào vector nhân dòng pJET1.2 để tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD..
- Đoạn gen CelD thu nhận từ phản ứng PCR được nối với plasmid nhân dòng đầu bằng pJET1.2 để tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD.
- Sản phẩm nối CelD và plasmid pJET1.2 được biến nạp vào tế bào E.
- Thu tế bào E.
- Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp Sản phẩm nối pJET1.2-CelD được biến nạp vào tế bào E.
- coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp các gen mục tiêu..
- coli DH5α từ các khuẩn lạc mọc được trên môi trường kháng sinh, sau đó kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R để xác định các khuẩn lạc đó có chứa plasmid tái tổ hợp quan tâm.
- Từ kết quả PCR, chọn những dòng có khả năng mang plasmid tái tổ hợp để tách plasmid và cắt kiểm tra với hai enzyme EcoRI và SnaBI.
- coli DH5α tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn, chọn một số dòng cho sản phẩm cắt phù hợp để giải trình tự với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R..
- coli DH5α tái tổ hợp vừa được sử dụng trong quá trình tạo vector biểu hiện mang gen mục tiêu..
- pJET1.2-CelD 1 µg.
- Plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD sau khi được kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt sẽ được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R.
- coli DH5𝜶 chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD Gen mã hóa CelD thu nhận từ vector nhân dòng pJET1.2-CelD bằng phản ứng cắt giới hạn với hai enzyme EcoRI và SnaBI.
- Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E.
- Sau đó, nối gen CelD vào plasmid biểu hiện pPIC9K đã cắt mở vòng để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD..
- coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp các gen mục tiêu.
- Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD sau khi được kiểm tra bằng phản ứng PCR khuẩn lạc và phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn sẽ chọn ra một dòng E.
- coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD gửi đi giải trình tự để kiểm tra trình tự gen mục tiêu đồng thời chuẩn bị cho thí nghiệm biến nạp vector biểu hiện vào Pichia pastoris..
- pastoris tái tổ hợp dạng Mut.
- Trộn 80 µl tế bào P.
- pastoris tái tổ hợp trên các nồng độ kháng sinh 0,25 – 4 mg/ml..
- pastoris tái tổ hợp trong thí nghiệm tiếp theo..
- Các dòng nấm men tái tổ hợp phát triển trên nồng độ kháng sinh cao nhất được tăng sinh trong môi trường BMGY.
- So sánh vòng phân giải của các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp..
- Đối chứng âm là chủng Pichia pastoris không chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD..
- coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp.
- coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50µg/ml).
- coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp mới sinh trưởng trên đĩa môi trường LB có bổ sung ampicillin..
- Ba dòng tế bào E.
- Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2 – CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp.
- giếng 4 – 6: sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi CelDF/ CelDR.
- 7: sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi pJET1.2F/ pJET1.2R.
- Kết quả điện di sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI ở giếng 1, 2, 3 tương ứng với các dòng E.
- coli DH5α E1, E2, E3 có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD..
- Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen CelD trong plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với trình tự có mã số X04584.1 bằng công cụ BLAST của NCBI..
- coli DH5𝛂 chứa plasmid pPIC9K mang gen CelD Sau khi kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự, plasmid pJET1.2 tái tổ hợp của dòng E2 và plasmid pPIC9K được cắt với enzyme cắt giới hạn là SnaBI và EcoRI.
- Tiến hành nối vector pPIC9K với gen mục tiêu bằng T4 DNA ligase ở 16 0 C qua đêm để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.
- coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD Các chủng biến nạp mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường LB đĩa thạch có chứa ampicillin (50 μg/ml).
- coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp gen mục tiêu và mẫu đối chứng dương là tế bào E.
- Đĩa biến nạp chứa các tế bào E.
- coli DH5𝛼 trên đĩa biến nạp và thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/AOX1R để chọn lọc những dòng mang plasmid tái tổ hợp gen mục tiêu..
- Để khẳng định các thể biến nạp chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD, tiến hành PCR khuẩn lạc các thể biến nạp với cặp mồi AOX1F/ AOX1R..
- coli DH5α EP2 và EP 6 có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD..
- Hai dòng tế bào E.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi CelDF/ CelDR và cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI..
- giếng 2: plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD chưa cắt.
- Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K- CelD với cặp mồi CelDF/ CelDR đặc trưng cho gen CelD của dòng EP2 và EP6 ở giếng 8 và 9 cũng cho vạch có kích thước bằng với kích thước gen đã được cắt ở giếng 6 và giếng 7.
- Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD chưa cắt ở giếng 2 cũng cho kích thước lớn hơn plasmid pPIC9K chưa cắt ở giếng 1.
- Như vậy cả hai dòng EP2 và EP6 có khả năng mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.
- Tuy nhiên, dựa vào sản phẩm cắt vẫn chưa thể khẳng định đã tạo dòng thành công tế bào E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD mà cần phải có thêm kết quả giải trình tự..
- coli DH5𝜶 chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD bằng giải trình tự.
- Plasmid tái tổ hợp của dòng EP2 được tiến hành giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) để kiểm tra lại trình tự của gen mục tiêu.
- coli DH5𝛼 mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.
- Từ đó tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào hệ thống Pichia pastoris nhằm nghiên cứu khả năng biểu hiện của enzyme endoglucanase..
- Plasmid tái tổ hợp pPIC9K- CelD được cắt bằng enzyme cắt giới hạn SacI và biến nạp vào tế bào Pichia pastoris để nghiên cứu biểu hiện gen..
- Như vậy, bước đầu đã thu nhận được các thể biến nạp Pichia pastoris GS115 mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD sáp nhập vào bộ gen.
- Các dòng tế bào P.
- giếng 3:sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi AOX1F/ AOX1R.
- Giếng 3 là sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD bằng cặp mồi AOX1F/ AOX1R cho một vạch có kích thước khoảng 2300 bp, kích thước này.
- Giếng 5 đến giếng 9 là sản phẩm PCR của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp chứa gen CelD bằng cặp mồi AOX1F/AOX1R.
- Đường kính vòng phân giải của các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp trên môi trường BMMY có CMC 0,5% được thể hiện trong bảng 4.1..
- Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp.
- Từ kết quả đo vòng phân giải cơ chất CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo, chứng tỏ đã biến nạp thành công các gen CelD vào tế bào P.
- pastoris và các dòng tái tổ hợp thu nhận được có khả năng tiết enzyme phân giải cellulose ra ngoại bào.
- coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pJET1.2 – CelD.
- coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K chứa gen CelD mã hóa cho enzyme endoglucanase D.
- Kiểm tra khả năng biểu hiện enzyme endoglucanase D từ các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp thu nhận được trên môi trường nuôi cấy Pichia pastoris với chất cảm ứng là methanol..
- Phân tích thành phần protein biểu hiện trong dịch nuôi cấy Pichia pastoris tái tổ hợp bằng điện di SDS-PAGE..
- Định lượng hoạt tính enzyme endoglucanase của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp..
- Phụ lục C: Kết quả xử lí số liệu đo vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp Summary Statistics for duong kinh

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt