- Phương pháp chủ yếu để định lượng HCV trong máu hiện nay là real-time polymerase chain reaction (real-time PCR), hay còn gọi là quantitative PCR (qPCR).. - Armored RNA là một thể giống virút bao gồm trình tự RNA của tác nhân cần định lượng được đóng gói trong protein vỏ của thực khuẩn thể (bacteriophage). - Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện tạo mẫu chuẩn HCV dùng trong định lượng HCV bằng công nghệ armored RNA.. - Nghiên cứu chế tạo mẫu chuẩn RNA bền với nucleases dùng trong định lượng virút viêm gan C. - Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thiết kế và tạo mẫu chuẩn có bản chất là một vùng trình tự RNA của virút viêm gan C (HCV) được đóng gói trong protein vỏ của thực khuẩn thể MS2 bằng công nghệ thiết kế armored RNA. - Vùng trình tự không mã hóa 5’UTR của HCV được khuếch đại và tạo dòng vào plasmid BH20. - AR-HCV được thu nhận bằng siêu ly tâm tỷ trọng sucrose, tinh sạch bằng cột sắc ký lọc gel Superdex 75 và được xác định nồng độ, đánh giá sự hình thành cấu trúc đóng gói virút bằng quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). - Kết quả đánh giá độ bền khi xử lý với đồng thời 2 enzyme DNase và RNase cho thấy AR-HCV có khả năng kháng các nucleases. - Ngoài ra, AR-HCV duy trì được tính ổn định ở các điều kiện và thời gian bảo quản khác nhau. - Khắc phục được hạn chế của các loại chất chuẩn khác, AR-HCV có thể bổ sung trực tiếp vào mẫu, giúp kiểm soát và đảm bảo độ chính xác của toàn bộ quy trình định lượng HCV.. - Thiết kế mồi và mẫu dò TaqMan đặc hiệu cho HCV Trình tự bộ gen HCV của 24 chủng đại diện cho các genotype, subtype khác nhau (bảng 2) được tham khảo và tải về từ cơ sở dữ liệu HCV (https://hcv.lanl.gov/content/. - Vùng trình tự nucleotide bảo tồn giữa các genotype được lựa chọn bằng phần mềm BLAST. - Trên vùng trình tự bảo tồn (vùng 5’UTR), mồi và mẫu dò TaqMan đặc hiệu cho HCV được thiết kế bằng phần mềm Primer-BLAST. - Cặp mồi dùng cho định lượng AR-HCV (mồi HCV-F và HCV-R) có khả năng khuếch đại đoạn trình tự có kích thước 237-240 bp, tuỳ theo genotype. - Cặp mồi để thiết kế AR-HCV (mồi 5’UTRHindIII-F và 5’UTRHindIII-R) có trình tự tương tự như mồi HCV-F và HCV-R, có gắn thêm trình tự của enzyme cắt giới hạn HindIII và 3 nucleotide phía trước ở đầu 5’ trên mỗi mồi, tạo sản phẩm khuếch đại có chiều dài 255 bp. - Các đoạn oligonucleotide đã thiết kế được kiểm tra các đặc tính kỹ thuật bằng phần mềm AmplifX để đảm bảo hoạt động tốt cho khuếch đại trình tự mục tiêu. - Trình tự mồi và mẫu dò thiết kế được trình bày trong bảng 1.. - Trình tự mồi và mẫu dò thiết kế dùng trong nghiên cứu.. - Mồi/Mẫu dò Trình tự (5’-3’). - Khuếch đại trình tự mục tiêu, tạo plasmid tái tổ hợp pAU2-HCV để tạo mẫu chuẩn armored RNA-HCV (AR- HCV). - Trình tự mục tiêu được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi HCV-F và HCV-R đã được thiết. - AR-HCV was collected by sucrose density gradient ultracentrifugation followed by gel filtration chromatography using Superdex 75 column. - Created AR-HCV was determined the concentration and examined the formation of pseudo viral particles by transmission electron microscopy (TEM). - Stability assessment of AR-HCV to DNase and RNase treatment simultaneously has demonstrated its ability to resist these nucleases. - Moreover, AR-HCV is stable over time and storage conditions. - Strikingly, AR-HCV can be directly added to the specimen, allowing better and more accurate control of the whole quantitative procedure of HCV.. - Plasmid BH20 chuyên dụng cho thiết kế AR, mang trình tự gen A mã hóa cho protein tập hợp (assembly protein) và protein vỏ (coat) của MS2 bacteriophage giúp cho sự đóng gói tạo cấu trúc virút giả (phage-like particles - PLP). - và trình tự promoter T7 kiểm soát sự biểu hiện của gen mục tiêu [6]. - coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp được chọn lọc trên đĩa môi trường LB agar có bổ sung kanamycin 50 µg/ml và được kiểm tra vùng trình tự mục tiêu HCV bằng phản ứng PCR khuẩn lạc. - coli BL21 (DE3) và cảm ứng sự biểu hiện AR-HCV. - Tế bào vi khuẩn sau khi biến nạp được sàng lọc và kiểm tra sự hiện diện của plasmid và đoạn chèn của trình tự mục tiêu bằng PCR và giải trình tự bằng phương pháp Sanger thực hiện trên hệ thống thiết bị giải trình tự tự động 3500 (Applied Biosystems).. - Sự biểu hiện AR-HCV được kiểm tra bằng điện di sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel (SDS-PAGE).. - Tinh sạch AR-HCV. - AR-HCV sau đó được tinh sạch bằng siêu ly tâm gradient tỷ trọng sucrose 45%. - Phân lớp chứa AR-HCV sau siêu ly tâm được thay đổi đệm TES (10 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) bằng Amicon ® Ultra-15 Centrifugal Filter Units (Merck) có kích thước màng lọc là 30 kDa, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút ở 4 o C với 3 lần thể tích đệm TES so với thể tích mẫu. - Dịch chứa AR- HCV sau đó được chạy qua cột sắc ký lọc gel Hiload 26/600 Superdex 75 prep grade (GE Healthcare) với đệm TES bằng hai lần thể tích cột theo hướng dẫn của nhà sản xuất.. - AR-HCV thu nhận sau mỗi bước tinh sạch được kiểm tra bằng SDS-PAGE. - Sự hình thành cấu trúc đóng gói virút giả của AR-HCV sau khi tinh sạch được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy - TEM) được thực hiện bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Y khoa Moscow (Nga).. - Định lượng AR-HCV. - AR-HCV sau khi tinh sạch được định lượng bằng phương pháp real-time PCR sử dụng bộ kit COBAS AmpliPrep/. - Kiểm tra tính kháng với các enzyme nuclease của AR- HCV thiết kế. - Tính ổn định của AR-HCV với các enzyme nuclease được xác định bằng cách ủ 1 ml dịch chứa AR-HCV với 100 U DNase I (Thermo Fisher Scientific) và 50 U RNase A (Thermo Fisher Scientific) ở 37 o C trong 2 giờ. - Đối chứng là plasmid pAU2-HCV và AR-HCV được xử lý nhiệt ở 95 o C trong 5 phút (xử lý nhiệt làm biến tính protein vỏ làm lộ RNA trần) [7]. - Khả năng kháng các nuclease của AR-HCV được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose (1%).. - Kiểm tra tính ổn định của AR-HCV trong điều kiện bảo quản. - AR-HCV được pha loãng bằng đệm TES bổ sung 0,05 mg/ml bovine serum albumin (BSA) về nồng độ 1×10 5 copies/ml rồi chia nhỏ vào các tube 1,5 ml, mỗi tube chứa 1 ml mẫu. - Các tube chứa AR-HCV được bảo quản ở -80 o C, -20 o C, 4 o C và 25 o C. - Tính ổn định theo thời gian được xác định bằng cách định lượng AR-HCV bằng real-time PCR với cặp mồi và probe thiết kế, tại các mốc thời gian bảo quản và 6 tháng). - Đối chứng là plasmid pAU2- HCV và AR-HCV được xử lý nhiệt ở 95 o C trong 5 phút (RNA trần). - Phân tích trình tự bộ gen HCV đã được công bố cho thấy, vùng 5’UTR có độ bảo tồn cao ở các genotype HCV khác nhau và đó là lý do vùng này thường được dùng trong các xét nghiệm phát hiện và định lượng HCV [8]. - Kết quả kiểm tra in-silico PCR sử dụng phần mềm AmplifX của cặp mồi thiết kế (HCV-F và HCV-R) cho thấy khả năng khuếch đại vùng trình tự có kích thước 237-240 bp trên vùng 5’UTR của tất cả các genotype, subtype khác nhau của HCV đã được công bố trên cơ sở dữ liệu HCV Genome Database (bảng 2).. - subtype Mã trình tự. - Thu nhận AR-HCV. - Vector biểu hiện pAU2-HCV mang đầy đủ các thông tin cần thiết để sản xuất AR-HCV. - Trên vector này có trình tự mã hóa cho protein A hỗ trợ quá trình đóng gói tạo AR-HCV, trình tự mã hóa cho protein coat làm vỏ của AR-HCV và trình tự vùng 5’UTR-HCV cần đóng gói. - Ở 37 o C, nồng độ IPTG cho sự biểu hiện AR-HCV tốt nhất cũng là 0,1 mM và giảm xuống khi tăng nồng độ IPTG (hình 1). - Nhìn chung, trong các điều kiện khảo sát, điều kiện tốt nhất để thực hiện cảm ứng sự biểu hiện AR- HCV là 0,1 mM IPTG ở 30 o C. - coli được siêu ly tâm gradient tỷ trọng sucrose để thu nhận AR-HCV (hình 2A). - Sự hiện diện của AR-HCV trong các phân lớp được xác định bằng SDS- PAGE và Western blot (hình 2B). - Kết quả cho thấy AR-HCV tập trung ở phân lớp dưới đáy. - Để đánh giá sự đóng gói hình thành cấu trúc virút giả (phage like particle - PLP), mẫu AR-HCV sau khi tinh sạch qua sắc ký lọc gel được phân tích bằng TEM.. - Từ ảnh TEM có thể thấy các hạt AR-HCV tạo ra có cấu hình nhị thập diện, kích thước 30-50 nm, tương tự với cấu trúc của thực khuẩn thể MS2 (hình 3).. - Tinh sạch thu nhận AR-HCV. - (A) Các phân lớp trong ống siêu ly tâm tỷ trọng sucrose thu nhận AR-HCV. - (C) Sắc ký đồ tinh sạch AR-HCV bằng cột lọc gel Hiload 26/600 Superdex 75 prep grade. - (D) Điện di SDS- PAGE kiểm tra các phân đoạn thu được từ sắc ký lọc gel mẫu AR-HCV.. - (D) Điện di SDS-PAGE kiểm tra các phân đoạn thu được từ sắc ký lọc gel mẫu AR-HCV.. - Cấu trúc AR-HCV nguyên vẹn sau khi tinh sạch được chụp bằng TEM.. - Nồng độ AR-HCV sau tinh sạch được xác định bằng real-time PCR (sử dụng bộ kit COBAS AmpliPrep/. - Bộ kit này sử dụng cặp mồi và probe để khuếch đại và phát hiện vùng 5’UTR của HCV, nằm trong vùng 5’UTR được nhân dòng để thiết kế AR-HCV, vì vậy có thể sử dụng để định lượng AR-HCV. - Kết quả định lượng cho thấy đã tạo được AR-HCV hiệu quả với số lượng lớn copies/ml).. - AR-HCV kháng với các nucleases. - Kết quả điện di gel agarose (1%) kiểm tra tính kháng của AR-HCV sau khi xử lý với 100 U/ml DNase và 50 U/ml RNase ở 37 o C trong 2 giờ. - 1 - AR-HCV. - 2 - AR-HCV xử lý với nucleases. - 5 - AR-HCV được xử lý nhiệt (95 o C, 5 phút) và xử lý với nucleases. - Kết quả điện di cho thấy chỉ có AR-HCV còn ổn định sau khi được xử lý đồng thời với DNase và RNase ở nồng độ cao, trong khi các phân tử plasmid DNA và RNA trần (AR- HCV được xử lý nhiệt ở 95 o C trong 5 phút) bị phân hủy hoàn toàn sau 2 giờ xử lý (hình 4). - Tính kháng lại nuclease làm cho AR-HCV trở nên ổn định, không bị phân hủy khi điều kiện bảo quản không đảm bảo sạch nuclease, vốn có ở khắp nơi trong môi trường xung quanh. - Kết quả điện di SDS-PAGE khảo sát điều kiện nhiệt độ và nồng độ IPTG cảm ứng sự biểu hiện AR-HCV của chủng E. - Do có đặc tính bền với các nucleases, AR-HCV có thể bổ sung trực tiếp vào mẫu máu hoặc huyết thanh, giúp kiểm soát và tăng độ chính xác của toàn bộ quy trình định lượng HCV.. - AR-HCV ổn định trong điều kiện và thời gian bảo quản Kết quả định lượng mẫu AR-HCV so sánh với mẫu plasmid (pAU2-HCV) và RNA trần (AR-HCV xử lý nhiệt ở 95 o C trong 5 phút), được bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau theo thời gian được trình bày trong hình 5. - Sau 6 tháng, nồng độ AR-HCV gần như không thay đổi so với ban đầu ở các điều kiện bảo quản -20 o C, 4 o C và 25 o C, đảm bảo được tính ổn định để làm mẫu chuẩn dùng cho định lượng.. - Biểu đồ đánh giá độ ổn định của AR-HCV theo điều kiện và thời gian bảo quản.. - Nghiên cứu đã tạo thành công mẫu chuẩn AR-HCV bằng công nghệ armored RNA có đặc tính bền và kháng tốt với nuclease. - Mẫu chuẩn được tạo ra bằng cách chèn một đoạn trình tự bảo tồn thuộc vùng 5’UTR của bộ gen HCV có khả năng phát hiện các genotype, subtype khác nhau của HCV vào vector pBH20 tạo thành vector tái tổ hợp pAU2-HCV.. - AR-HCV được sản xuất bằng cách cảm ứng sự biểu hiện trong tế bào E. - Sau khi thu nhận và tinh sạch bằng siêu ly tâm tỷ trọng succrose và sắc ký lọc gel, AR-HCV được đánh giá khả năng đóng gói RNA thành cấu trúc virút giả bằng ảnh TEM và được định lượng bằng real-time PCR với nồng độ copies/ml.. - AR-HCV được chứng minh tính kháng với nuclease khi ủ với 100 U/ml DNase và 50 U/ml RNase trong 2 giờ và ổn. - Mẫu chuẩn AR-HCV được tạo ra từ nghiên cứu có khả năng ứng dụng trong các phương pháp sinh học phân tử như real-time PCR để định lượng HCV.
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt