- NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐOẠN MÃ VẠCH ADN (DNA BARCODE) CHO LOÀI ÁO CỘC (Liriodendron chinense). - Áo cộc (Liriodendron chinense) là loài cây được đánh giá có giá trị kinh tế với cây làm cảnh, gỗ tốt. - Vì vậy, việc xác định các đoạn mã vạch ADN cho loài Áo cộc phục vụ giám định loài là cần thiết. - ADN tổng số được phân lập từ lá cây Áo cộc. - Sản phẩm PCR chỉ ra rằng các băng thu được có kích thước giống với kích thước dự kiến, sau đó sản phẩm PCR được xác định trình tự nucleotide. - Kết quả phân tích trình tự đã chỉ ra, đoạn rbcL có 658 nucleotide, đoạn matK có 543 nucleotide và đoạn trnH-psbA có 382 nucleotide. - Các trình tự này sau đó được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NCBI đã tìm ra sự khác biệt với các loài Áo cộc khác: đoạn gen matK tương đồng 100% với loài Liriodendron chinense, đoạn gen rbcL tương đồng 99,1% với loài Liriodendron chinense, đoạn gen trnH-psbA tương đồng 92,4% với loài Liriodendron chinenses. - Với 3 đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, nghiên cứu cho thấy rằng sử dụng đoạn gen trnH-psbA làm mã vạch ADN để giám định loài Áo cộc ở Việt Nam là tốt nhất.. - Áo cộc (L. - Áo cộc là một trong mười sáu kiểu che phủ rừng, mức độ thống trị của loài này đã tạo ra sự khác biệt giữa các cộng đồng sinh thái không những thế nó còn có giá trị như một nguồn mật hoa để sản xuất mật ong, một nguồn thực phẩm tự nhiên, một loài cây cảnh cho bóng mát lớn tại các đô thị (AGM Plants - Ornamental. - Áo cộc đang bị đe dọa và đã được liệt kê trong danh sách các loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng vì hiệu quả sinh sản thấp, tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp, điều này ảnh hưởng rất lớn tới việc nhân giống và. - Do đó, việc nghiên cứu xác định các đoạn mã vạch ADN cho loài Áo cộc phục vụ giám định loài là cần thiết và cấp bách cho việc định danh và bảo tồn loài Áo cộc tại Việt Nam.. - Ở động vật, đoạn mã vạch ADN được sử dụng cho phần lớn các loài là đoạn gen ở ty thể cytochrome C oxidase (CO1) (Anders R., 2012. - Ở thực vật, tốc độ tiến hóa của các đoạn gen ty thể không nhanh như ở động vật do đó đoạn CO1 không được sử dụng. - Trong nghiên cứu này, tiến hành lựa chọn ba đoạn trình tự ADN để sử dụng làm mã vạch ADN là: rbcL, matK và TrnH-psbA. - Trong số đó, các đoạn rbcL, TrnH-psbA và matK là các đoạn ADN nằm ở hệ gen lục lạp. - Các đoạn trình tự này đều có tính đặc trưng cao cho loài, có thể đem lại kết quả khả quan nhằm phân. - loại, giám định và xác định mối quan hệ di truyền, từ đó góp phần nâng cao hiệu quả bảo tồn và phát triển loài Áo cộc ở Việt Nam.. - Đối tượng nghiên cứu: Loài Áo cộc thu thập tại núi Luốt Trường Đại học Lâm nghiệp - Xuân Mai - Chương Mỹ - Hà Nội (hình 1).. - Ảnh lá, hoa của cây Áo cộc. - Kí hiệu các mẫu Áo cộc được lấy:. - Trình tự các cặp mồi rbcL (rP1F:. - mồi TrnH-psbA (trnPF1:. - Cả 3 trình tự mồi rbcL, TrnH-psbA, matK được xây dựng dựa trên các đoạn gen thuộc hệ gen lục lạp.. - Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá của cây Áo cộc theo hướng dẫn sử dụng Kit (Plant ADN Isolation Kit) của hãng Norgen. - Nhân bản các đoạn gen rbcL, matK, và TrnH-psbA từ các mẫu ADN tổng số bẵng kỹ thuật PCR trên máy PCR 9700, mỗi phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 20 μl, bao gồm: H 2 O deion (7 µl), 2x PCR Master mix Solution (10 µl), 10 pmol/µl mồi xuôi (1,0 µl), 10 pmol/µl mồi ngược (1,0 µl) và 50 ng/µl ADN khuôn (1 µl). - Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR được gửi cho phòng thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để giải trình tự.. - Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xử lý, phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng như Bioedit, ADNClub, Biohit, Mega10. - Trình tự nucleotide của các đoạn. - gen rbcL, matK và TrnH-psbA được so sánh trên Ngân hàng Gen Quốc tế (NCBI) để tìm ra các loài tương đồng. - Xây dựng cây phát sinh chủng loại của từng đoạn gen bằng sử dụng các công cụ trên NCBI.. - Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá cây Áo cộc. - ADN tổng số sau khi được tách chiết từ các mẫu lá cây Áo cộc bằng Kit tách chiết của hãng Norgen được pha loãng để xác định nồng độ và độ tinh sạch. - Ảnh điện di ADN tổng số của 3 mẫu Áo cộc (Ac.1: Áo cộc 1. - Ac.2: Áo cộc 2. - Ac.3: Áo cộc 3). - cây Áo cộc được sử dụng làm khuôn để nhân bản các đoạn gen rbcL, TrnH-psbAvà matK bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu.. - Kết quả PCR các đoạn gen trnH-psbA, matK, rbcL của Áo cộc. - sản phẩm này để xác định trình tự nucleotide.. - Kết quả xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn mã vạch ADN. - Trình tự ADN đoạn gen matK. - Kết quả xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen matK được nhân bản có kích thước 543 bp. - Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của mẫu Áo cộc như hình 4.. - Trình tự này sau đó được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác biệt ở cấp độ loài và các loài có trình tự tương đồng với đoạn gen matK ở loài Áo cộc bằng cách sử. - Một số loài có trình tự gen tương đồng với loài Áo cộc được trình bày ở bảng 1.. - Một số loài có trình tự đoạn gen matK tương đồng với loài Áo cộc trên ngân hàng gen NCBI. - Sau đó chúng tôi sử dụng phần mềm Mega X để xây dựng cây phát sinh chủng loại tìm ra mối quan hệ của loài Áo cộc chúng tôi nghiên. - Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn matK được tạo bởi phần mềm MegaX. - Bằng phần mềm Mega X, nghiên cứu nhận được khoảng cách di truyền của loài Áo cộc. - Bảng so sánh khoảng cách di truyền của loài Áo cộc với các loài khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI dựa trên đoạn trình tự matK. - Từ cây phân loại dựa trên số liệu trình tự đoạn gen matK kết hợp với khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng của loài Áo cộc với các loài khác ta thấy: loài Áo cộc trong nghiên cứu này có trình tự gen giống 100% với đoạn gen của loài Liriodendron chinense Trung Quốc với khoảng cách di truyền là 0.00 (hệ số tương đồng 100%) và có quan hệ xa nhất với loài Magnolia amazonica với khoảng cách di. - Trình tự ADN đoạn gen rcbL. - Kết quả xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen rbcL được nhân bản có kích thước 676 bp. - Kết quả giải trình tự đoạn gen rbcL của mẫu Áo cộc như hình 6.. - Trình tự ADN đoạn gen rcbL Trình tự này sau đó được xử lý trên ngân. - hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác biệt ở cấp độ loài và các loài có trình tự tương đồng theo đoạn gen rbcL ở loài Áo cộc bằng cách sử. - Một số loài có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài Áo cộc được trình bày ở bảng 3.. - Một số loài có trình tự gen rbcL tương đồng với loài Áo cộc trên ngân hàng gen NCBI. - Nghiên cứu sử dụng phần mềm Mega X để xây dựng cây phát sinh chủng loại (hình 7) tìm ra mối quan hệ của loài Áo cộc với các loài. - Bảng so sánh khoảng cách di truyền của loài Áo cộc với các loài khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI dựa trên đoạn trình tự rbcL. - Bằng phần mềm Mega X nghiên cứu nhận được khoảng cách di truyền của loài Áo cộc. - Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL được tạo bởi phần mềm MegaX. - Từ cây phát sinh chủng loại dựa trên số liệu trình tự đoạn gen rbcL kết hợp với khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng của loài Áo cộc với các loài khác ta thấy: loài Áo cộc có quan hệ gen gần nhất với các loài Liriodendron chinense, Liriodendron tulipifera với khoảng cách di truyền là 0.0084 (hệ số tương đồng 99.11%) và xa nhất với loài Magnolia decidua. - Trình tự DNA đoạn gen TrnH-psbA Kết quả xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen TrnH-psbA được nhân bản có kích thước 382 bp (kích thước nhỏ hơn so. - với kích thước trên bản gel của PCR vì sau khi đọc trình tự nghiên cứu tiến hành xử lý cắt bỏ một số đoạn trình tự bị nhiễu ở đầu đoạn các. - chiều xuôi và chiều ngược của trình tự để thu được trình tự chuẩn). - Kết quả giải trình tự đoạn gen TrnH-psbA của mẫu Áo cộc như hình 8.. - Trình tự ADN đoạn gen TrnH-psbA Trình tự này sau đó được xử lý trên ngân. - hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác biệt ở cấp độ loài và các loài có trình tự tương đồng theo đoạn gen TrnH-psbA ở loài Áo cộc bằng. - Một số loài có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài Áo cộc được trình bày ở bảng 5.. - Bảng so sánh khoảng cách di truyền của loài Áo cộc với các loài khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI dựa trên đoạn trình tự TrnH-psbA. - Bằng phần mềm Mega X, nghiên cứu xây dựng cây phát sinh chủng loại (hình 9) tìm ra mối quan hệ của loài Áo cộc với các loài khác. - Bảng so sánh khoảng cách di truyền của loài Áo cộc với các loài khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI của đoạn trình tự TrnH-psbA. - Bằng phần mềm Mega X chúng tôi nhận được khoảng cách di truyền của loài Áo cộc với các loài khác như hình 9.. - Từ cây phát sinh chủng loại kết hợp với khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng dựa trên số liệu trình tự đoạn gen TrnH-psbA ta thấy: loài Áo cộc có quan hệ gen gần nhất với loài Liriodendron chinense với khoảng cách di truyền là 0,0876 (hệ số tương đồng 91,88%). - Như vậy, dựa vào cây phân loại của cả 3 đoạn gen rbcL, matK và trnH-psbA đều cho thấy loài Áo cộc thuộc loài Liriodendron chinense với các tỷ lệ tương đồng 100% của đoạn gen matK, 99,1% của đoạn gen rbcL, 92,4% của đoạn gen trnH-psbA.. - Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn TrnH-psbA được tạo bởi phần mềm MegaX Dựa vào kết quả so sánh trình tự các đoạn. - gen matK, rbcLvà trnH-psbA của Áo cộc với trình tự gen của loài Liriodendron chinenes công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI với. - mã số KU170535.1, ta lập được bảng so sánh khả năng phân biệt của đoạn trình tự matK, rbcL và trnH-psbA như bảng 7.. - Bảng so sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA. - Tên đoạn gen matK rbcL trnH-psbA. - Kích thước trình tự . - Kết quả phân tích cho thấy khi so sánh trình tự matK, rbcL và trnH-psbA của loài Áo cộc với trình tự gen của loài Liriodendron chinenes công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KU170535.1 : trình tự đoạn gen matK có 0 điểm sai khác, trình tự đoạn gen rbcL có 6 điểm sai khác và trình tự đoạn gen trnH-psbA có 29 điểm sai khác. - Tỉ lệ sai khác của trình tự trnH-psbA là cao nhất (7,6%) do đó khả năng phân biệt loài của gen trnH-psbA cũng là tốt nhất và tỉ lệ sai khác của trình tự matK là thấp nhất (0%) đồng nghĩa với khả năng phân biệt loài kém nhất trong 3 gen. - Như vậy, đoạn trnH-psbA có khả năng phân biệt cao hơn so với đoạn matK và rbcL khi so sánh loài Áo cộc với loài Liriodondren chinense. - cách tốt nhất là sử dụng đồng thời cả 3 đoạn trình tự matK, rbcL và trnH-psbA để có thể xác định chính xác nhất loài cần định danh.. - Với chỉ thị matK chúng tôi thu được kết quả loài Áo cộc chúng tôi nghiên cứu giống 100%. - với loài Áo cộc ở Trung Quốc được công bố trên ngân hàng gen NCBI và có sự sai khác nhỏ với loài Liriodendron tulipifera. - thùy giữa lá sâu hơn so với loài Áo cộc và hoa của loài Áo cộc có màu cam trong khi đó loài L.chinense có màu xanh lục hoặc vàng nhạt.. - Với chỉ thị phân tử rbcL và trnH- psbA chúng tôi nhận được loài Áo cộc có quan hệ gần nhất với các loài Liriodendron chinense, với khoảng cách di truyền lần lượt là 0,00894 và 0,0876. - Như vậy với các chỉ thị này cho thấy loài Áo cộc nghiên cứu lấy tại Việt Nam có sự sai khác với loài Áo cộc nhận được trên ngân hàng gen quốc tế NCBI.. - Dựa vào kết quả so sánh đặc điểm hình thái cùng với so sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA của loài Áo cộc, ta thấy được rằng: Để định danh cho loài Áo cộc chúng tôi sử dụng đoạn gen matK với tỷ lệ tương đồng 100% với L. - Để phân biệt loài nghiên cứu sử dụng đoạn gen trnH-psbA với tỷ lệ sai tương đồng 92,4% với L. - Các vùng gen rbcL, matK, và trnH-pbsA được giải trình tự nucleotide với các kích thước như sau: đoạn rbcL có kích thước là 658 bp, đoạn matK có 543 bp và đoạn TrnH-psbA có 382 bp. - So sánh trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch ADN (rbcL, matK, và TrnH- psbA) của loài Áo cộc với trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch tương ứng của các loài khác trên NCBI đã chỉ ra: loài Áo cộc thuộc loài L.chinense với các tỷ lệ tương đồng 100%. - của đoạn gen matK, 99,1% của đoạn gen rbcL, và 92,4% của đoạn gen trnH-psbA với các giá trị bootstrap rất cao 100%. - chinense chúng tôi tìm ra được: Để định danh cho loài Áo cộc chúng tôi sử dụng đoạn gen matK, để phân biệt loài chúng tôi sử dụng đoạn gen trnH-psbA bởi đoạn TrnH-psbA có khả năng phân biệt loài cao hơn so với đoạn rbcLvà matK. - Tuy nhiên, chính xác nhất nên sử dụng cả 3 chỉ thị để định danh loài Áo cộc ở Việt Nam.. - The PCR results indicated that all DNA bands have a size similar to the theoretical size of rbcL, matK and TrnH-psbA fragments. - Finally, in three of gene fragment: matK, rbcL, TrnH-psbA we found that It is best for using TrnH-psbA molecular marker as DNA barcode to identify Liriodendron chinense in Vietnam.
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt