Tách dòng và biểu hiện gen mã hoá Tyrosinase từ Aspergillus Oryzae TP01

- luận văn thạc sĩ khoa học Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa Tyrosinase từ aspergillus oryzae tp01 ngành : công nghệ sinh học mã số Nguyễn thị hoa Ngời hớng dẫn khoa học: GS.TS.
- Ứng dụng của tyrosinase.
- Hệ vector biểu hiện trong Pichia pastoris.
- Tế bào chủ.
- Hệ thống cỏc tế bào chủ trong biểu hiện gen.
- Tế bào chủ Pichia pastoris.
- Phương phỏp.
- Phương phỏp biến nạp.
- Biểu hiện gen mó hoỏ tyrosinase trong Pichia pastoris X33.
- Thiết kế vector biểu hiện tyrosinase ở Pichia pastoris X33.
- 69 3 BẢNG VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic axit Amp Ampicilliin AOX Alcohol oxidase ARN Axit ribonucleic cDNA Complementary DNA DEPC Diethylpyrocarbonate DHAS Dihydroxyacetone synthase dNTP Deoxyribonucleic triphosphate DTT Dithiothreitol (C4H10O2S2 W = 154,25) EDTA Ethylenediaminetetraacetic EtBr Ethidium bromide FLD Formaldehyde dehydrogenase FMLD Formate dehydrogenase kDa Kilo Datol LB Lauria- bertani medium MD Minimal dextrose medium OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RE Restriction enzyme RT Reverse transcription SCED Sorbitol citrat natri EDTA DTT SDS Sodium dodecyl sulphate TE Tris - EDTA TYR Tyrosinase YPD Yeast pepton dextrose YPDSZ Yeast pepton dextrose sorbitol zeocin 4 DANH MỤC CÁC HèNH Hỡnh Tờn hỡnh Trang 1.1 Phản ứng chuyển húa dưới sự xỳc tỏc của tyrosinase 10 1.2 Cấu trỳc xoắn ốc α của Tyrosinase 10 1.3 Cấu tạo trung tõm hoạt động của Tyrosinase 12 1.4 Phản ứng tạo Hemocyamin từ Deoxy-tyrosinase 12 1.5 Tyrosinase xỳc tỏc chuyển hoỏ cả hai dạng mono và di-phenol 16 1.6 Cơ chế xỳc tỏc của tyrosinase với sự tham gia của phõn tử O2 18 1.7 Phản ứng oxy húa pirocatechol dưới tỏc dụng của catecholase 18 1.8 Quỏ trỡnh tổng hợp melanin trong cỏc tế bào động vật 19 1.9 Vị trớ bảo thủ CuA và CuB của tyrosinase ở cỏc loài nấm khỏc nhau 24 1.10 So sỏnh trỡnh tự axit amin của gen mel O của A.oryzae với Neurospora crassa 25 1.11 Sơ đồ vector pCR 2.1 (Invitrogen) 27 1.12 Sơ đồ vector pPICZα 30 2.1 Sơ đồ tổng hợp cDNA sợi đơn 39 2.2 Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR 40 2.3 Phản ứng gắn ADN vào vector tỏch dũng pCR Gắn pPICZ αA mang gen vào Pichia pastoris 46 3.1 ARN tổng số từ Aspergillus oryzae TP01 48 3.2 Sản phẩm PCR trờn agarose 1% 50 3.3 Khuẩn lạc E.coli Top10F mang vector tỏch dũng 51 3.4 Điện di đồ tỏch ADN plasmid tỏch dũng 52 3.5 Kiểm tra ADN plasmid mang gen TYR bằng EcoR I 53 3.6 Sơ đồ qui trỡnh hoàn chỉnh gen TYR-VN 59 3.7 Điện di đồ trờn gel agarose 1% 61 3.8 Sản phẩm PCR với mồi biểu hiện trờn gel agarose 1% 63 3.9 Sơ đồ vector biểu hiện gen TYR trong Pichia pastoris 64 3.10 Khuẩn lạc Ecoli Top10F’ mang vector biểu hiện 65 3.11 Điện di đồ AND plasmid biểu hiện vào E.coli Top 10F’ 65 3.12 Sản phẩm cắt pPICZαA-TYR 66 3.13 Sản phẩm cắt mở vũng 67 5 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tờn bảng Trang 1.1 Tớnh chất của tyrosinase của một số loại nấm 15 1.2 Số axit amin mó hoỏ tyrosinase ở cỏc loài khỏc nhau 23 1.3 Trỡnh tự axit amin của gen melO 24 1.4 Thành phần và cỏc vị trớ của vector tỏch dũng pCR2.1 28 1.5 Thành phần của vector pPICZα 30 1.6 Cỏc loại tế bào chủ chủ yếu 31 3.1 Trỡnh tự mồi của TYR5 49 3.2 Trỡnh tự mồi của TYR3 49 3.3 Trỡnh tự gen TYR5 54 3.4 Trỡnh tự gen TYR3 55 3.5 Vị trớ của cỏc enzym cắt giới hạn trờn TYR5 56 3.6 Vị trớ của cỏc enzym cắt giới hạn trờn TYR3 57 3.7 Trỡnh tự đoạn gen TYR mó húa cho tyrosinse từ A.oryzae TP01 60 3.8 Cỏc enzym cắt giới hạn khụng cắt trong gen TYR 62 3.9 Mồi biểu hiện cho TYR 63 6 MỞ ĐẦU Tyrosinase là enzym được nhiều nhà khoa học trờn thế giới quan tõm nghiờn cứu từ nhiều năm qua.
- Để tạo được tyrosinse tỏi tổ hợp việc chọn tế bào chủ để biểu hiện là vấn đề rất quan trọng.
- Tyrosinas từ Aspergillus oryzae TP01 (chủng gốc) cú hoạt tớnh tyrosinase nội bào, phải phỏ vỡ màng tế bào gõy khú khăn khi thu nhận và làm tăng giỏ thành chế phẩm enzym.
- Do vậy chỳng tụi chọn tế bào chủ là chủng nấm men Pichia pastoris với vector biểu hiện pPICZαA cú tớn hiệu α-factor là yếu tố tạo protein ngoại bào, thuận lợi cho quỏ trỡnh thu nhận enzyme.
- Tạo vector biểu hiện cho tyrosinase trong nấm men Pichia pastoris.
- Biểu hiện tyrosinase trong Pichia pastoris X33.
- Cõy thuốc lỏ: Nicotiana tabacum∗ Tyrosinase từ động vật Tyrosinase trong tất cả cỏc tế bào động vật cú chức năng hỡnh thành sắc tố melanin bởi nú xỳc tỏc chuyển húa L-tyrosine thành L-Dopa và từ L-Dopa chuyển thành dopaquinon và cuối cựng tạo melanin.
- Quỏ trỡnh tổng hợp melanin trong cỏc tế bào động vật 1.1.4.
- So sỏnh trỡnh tự axit amin của gen mel O của A.oryzae với Neurospora crassa Gen tyrosinase được biểu hiện ở cỏc tế bào chủ khỏc nhau như E.coli, Saccharomyces cerevisia, A.oryzae, Pichia pastoris.
- Tuy nhiờn melB được biểu hiện cao trong solid state culture, cũn mel O được biểu hiện cao trong submerged culture [21].
- Do đú khi biểu hiện cần dựa vào mục đớch thu nhận tyrosinase, cấu trỳc của gen để lựa chọn tế bào chủ.
- VECTOR VÀ TẾ BÀO CHỦ 1.2.1 Khỏi niệm vector Vector là một ADN, thường cú dạng vũng, mang nhiều đặc tớnh trong đú cú khả năng xõm nhập vào tế bào và mượn bộ mỏy tế bào để tạo ra nhiều sản sao khỏc giống hệt vector ban đầu.[1] 1.2.2 Vector tỏch dũng pCR2.1 Vector tỏch dũng (cloning vector) cũn gọi là phương tiện vận chuyển gen, được sử dụng để khuếch đại số lượng bản sao của một gen hay trỡnh tự ADN nhất định, chuyển cỏc gen ngoại lai vào tế bào hoặc sản xuất protein với số lượng lớn từ cỏc gen tỏch dũng.
- Là cỏc phõn tử ADN cú kớch thước nhỏ, cho phộp cài (gắn) cỏc gen cần thiết và cú khả năng sao chộp độc lập khụng phụ thuộc vào sự phõn chia của tế bào.
- Cú khả năng tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ, ớt gõy biến đổi bộ gen của tế bào chủ.
- Phải mang gen “ tớn hiệu“ để dễ dàng nhận biết cỏc tế bào mang vector tỏi tổ hợp.
- phage, cosmid, phagemid, nhiễm sắc thể nhõn tạo của tế bào nấm men, Vector tỏch dũng là virus của tế bào eukaryote (.cỏc loại virus SV40 (Simian virus), adenovirus, retrovirus, baculovirus, virus herpes..),cú những ưu, nhược điểm nhất định.
- Tuỳ thuộc kớch thước của gen cần tỏch dũng và đặc điểm của loại tế bào chủ để chọn loại vector tỏch dũng thớch hợp.
- Ngoài ra, vector pCR2.1 cú chứa gen khỏng Ampicillin và Kanamycin cho phộp lựa chọn cỏc tế bào mang plasmid sinh trưởng bỡnh thường trờn mụi trường cú chứa Ampicillin hoặc Kanamycin với nồng độ ức chế tối thiểu 100μg/ml.
- Cỏc vector biểu hiện là vector cú thể mang cỏc gen ngoại lai mong muốn cho phộp thực hiện sự phiờn mó của cỏc bản sao được tạo dũng và sự dịch mó cỏc mRNA của chỳng trong tế bào chủ.
- Vector biểu hiện phải cú đủ cỏc cấu trỳc cần thiết.
- Cỏc trỡnh tự mó húa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trỡ vector trong tế bào.
- Hệ biểu hiện P.
- pastoris cũng như cỏc hệ thống khỏc, được xõy dựng dựa trờn hệ thống vector biểu hiện trong Escherichia coli.
- Qua nhiều năm nghiờn cứu cỏc nhà khoa học đó tạo ra nhiều loại vector biểu hiện cũng như chủng P.
- Hầu hết cỏc vector biểu hiện trong Pichia pastoris cú chứa đoạn trỡnh tự AOX1 promoter (0,9 kb) gồm trỡnh tự 5’ promoter và trỡnh tự nhỏ khỏc cần thiết khỏc cho quỏ trỡnh kết thỳc quỏ trỡnh phiờn mó (AOX1 transcription terminator).
- thụng thường thỡ kết quả biểu hiện gen ngoại lai tốt nhất khi trỡnh tự ATG của gen ngoại lai nằm gần trỡnh tự ATG của gen AOX1.
- Thành phần của vector pPICZα 5’ AOX1 Là đoạn cú 942bp, gồm promoter AOX1 cú khả năng điều khiển sự tiờu thụ methanol, được biểu hiện cao trong P.pastoris.
- Tớn hiệu tiết protein ngoại bào (α-factor) Đõy là đặc điểm nổi bật nhất khi dựng vector này biểu hiện trong P.pastoris Vị trớ đa điểm (multiple cloning site)(với 10 vị trớ của enzym cắt giới hạn) Cho phộp cài gen cần biểu hiện vào vector biểu hiện Myc epitope (biểu vị) tag đầu C (Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn) Cú thể xỏc định protein hũa tan (fusion protein) bởi khỏng thể khỏng myc hoặc khỏng thể khỏng myc HRP Polyhistidine tag đầu C Cú thể tinh sạch protein hũa tan tỏi tổ hợp dựa trờn sự liờn kết với kim loại.
- Vựng kết thỳc phiờn mó của AOX1 (TT) Vựng kết thỳc phiờn mó và tớn hiệu polyA từ gen AOX1( ~260bp) Promoter TEF1 Promoter kộo dài phiờn mó từ Saccharomyces 30 cerevisiae EM7 (tổng hợp tiền promoter) Promotor dựng để biểu hiện gen Sh ble trong E.coli Gen sh ble (Streptoalloteichus hindustanus ble) Gen khỏng Zeocin Vựng kết thỳc phiờn mó CYC1 pUC origion Đảm bảo sự tỏi bản và bảo tồn plasmid trong E.coli Sac I, Pme I, BstX I Enzym cắt giới hạn cắt mở vũng vector ở AOX1 để cú thể gắn với genom của Pichia 1.2.4.
- Tế bào chủ 1.2.4.1.
- Hiện nay cú 4 hệ tế bào chủ thường được sử dụng để biểu hiện gen như E.coli, B.subtilis, nấm men (S.
- Pastoris) và tế bào động vật.
- Cỏc loại tế bào chủ chủ yếu Cỏc nhúm chớnh Kiểu loại nhõn Kiểu loại tế bào Thớ dụ Vi khuẩn Nhõn sơ Gram õm Gram đương Escherichia coli Bacillus subtilis Streptomyces spp Nấm Nhõn chuẩn Vi sinh vật Cú khuẩn ty Sacchromyces cerevisiae Pichia pastoris Aspergillus nidulans Thực vật Nhõn chuẩn Tế bào trần Tế bào nguyờn Cả cơ thể Cỏc loại khỏc nhau Cỏc loại khỏc nhau Cỏc loại khỏc nhau Động vật Nhõn chuẩn Tế bào sõu bọ Tế bào động vật Tế bào trứng Cả cơ thể Drosophila melanogaster Cỏc loại khỏc nhau Cỏc loại khỏc nhau Cỏc loại khỏc nhau 31 E.coli là vi khuẩn gram õm, cú một nhiễm sắc thể riờng lẻ nằm trong cấu trỳc gọi là vựng nhõn, hệ gen cú kớch thước khoảng 4.106 cặp bazơ, là một vật chủ đơn giản nhất được sử dụng rộng rói.
- Cỏc quỏ trỡnh biểu hiện gen (phiờn mó và dịch mó) đi đụi với nhau, sinh ra sợi mARN được tổng hợp mới và được sử dụng ngay cho quỏ trỡnh dịch mó.
- Khụng cú hiện tượng sửa đổi sau phiờn mó đối với sản phẩm phiờn mó ban dầu như thường xảy ra trong cỏc tế bào nhõn chuẩn.
- [4] B.subtilis và nấm men khụng phải là hệ biểu hiện được sử dụng rộng như E.coli nhưng hệ này cú nhiều ưu điểm đỏng chỳ ý.
- B.subtilis cú khả năng biểu hiện và tiết rất tốt protein cú nguồn gốc từ procaryot ra ngoài mụi trường nuụi cấy, cũn nấm men lại cú những ưu điểm quan trọng của cả procaryot và eucaryot.
- Nấm men sinh trưởng nhanh và cú khả năng chế biến protein sau khi dịch mó tốt để trở thành dạng hoạt động mà hệ biểu hiện ở vi khuẩn khụng cú.
- Vỡ vậy, nấm men rất được ưa chuộng để biểu hiện cỏc gen của eucaryot và gen mó hoỏ cho protein sử dụng trong thực phẩm và chữa bệnh.[4] Hệ biểu hiện trong tế bào động vật cú khả năng biểu hiện được tất cả cỏc protein của 4 nhúm nhưng tốn thời gian và quỏ trỡnh chọn lọc, nhõn dũng và nuụi cấy dũng tế bào phức tạp hơn nờn hệ biểu hiện này thường khụng được sử dụng rộng rói.[4] Nấm men Sacchromyces cerevisiae là một vi sinh vật nhõn chuẩn được ưa thớch để nghiờn cứu kĩ thuật di truyền.
- Bởi vỡ S.cerevisiae cú độ an toàn sinh học cao, bản thõn tế bào S.cerevisiae cú hàm lượng protein, vitamin rất lơn, cú giỏ trị dinh dưỡng cao thường được bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho người và động vật.
- Plasmid dựng để biểu hiện gen trong S.cerevisiae dạng đa phiờn bản rất dễ bị mất dần qua một số thế hệ.
- Promotor dựng để khởi đầu phiờn mó gen ngoại lai như promotor của hệ gen đường hoỏ dễ bị thay đổi, ảnh hưởng tới việc biểu hiện gen.
- Bờn cạnh đú, S.cerevisiae chưa cú hệ vector biểu hiện hữu hiệu, chưa cú hệ promotor mạnh được điều khiển chặt chẽ bởi chất cảm ứng.
- [4] Để khắc phục những nhược điểm của hệ biểu hiện gen trong S.cerevisiae , nấm men Pichia pastoris đó được sử dụng như một hệ biểu hiện thay thế.
- Tế bào chủ Pichia pastoris Hệ biểu hiện Pichia pastors khắc phục được những nhược điểm của hệ biểu hiện S.cerevisiae, trở thành hệ thống biểu hiện gen ngoại lai cực kỳ hữu hiệu với cỏc đặc điểm nổi trội:[4.
- Cú promoter AOX I (alcohol oxidase I) đặc hiệu cho việc kiểm soỏt việc biểu hiện cỏc gen ngoại lai, bằng nguồn C cú trong mụi trường.
- Plasmid được sử dụng để biểu hiện gen thường được trao đổi chộo với hệ gen của nấm men nờn làm tăng tớnh ổn định của plasmid trong tế bào.
- Kit biểu hiện đó được cụng ty Invitrogen thương mại húa.
- Tất cả cỏc chủng này, kể cả chủng Mut- đều duy trỡ khả năng biểu hiện protein ngoại lai ở mức độ cao bởi AOX1 promoter.[20] Một số chủng thiếu hụt protease như SMD1163 (his4 pep4 prb1), SMD1165 (his4 prb1), và SMD1168 (his4 pep4) cú khả năng giảm thiểu sự phõn hủy protein ngoại lai do sự thiếu hụt protease, điều này rất quan trọng khi tiến hành lờn men thu protein ngoại bào.
- Vector biểu hiện pPICZαA - Chủng biểu hiện Pichia pastoris X33 2.1.2.
- Húa chất Cao nấm men, Trypton, Agar, Glucose, Agar bacter, Ampicilin, X-gal, EDTA, SDS, Chloroform, Iso amylalcohol, Phenol, Ethanol, Tris-HCl, Agarose, EtBr, Glycerol, ethidium bromide, cỏc loại enzym giới hạn, vector tỏch dũng pCR2.1, vector biểu hiện pPICZαA, cỏc bộ kit.
- Phương phỏp 2.2.1.
- Phản ứng gắn ADN vào vector tỏch dũng pCR 2.1 * Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli Top10 F Nguyờn tắc: Tế bào vi khuẩn được hoạt húa nhờ nuụi cấy trong mụi trường mới đến đầu pha log, được làm sạch nhiều lần với CaCl2 100mM.
- Dưới tỏc dụng của CaCl2 thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nờn xốp, tạo điều kiện cho ADN cú thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt.
- Sau đú cấu trỳc màng sẽ được phục hồi, kết quả là ADN được giữ lại trong tế bào.
- Tế bào chứa ADN tỏi tổ hợp cú mang gen chỉ thị khỏng khỏng sinh nờn cú thể sinh trưởng trong mụi trường cú khỏng sinh.
- Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.coli Top10 F’ bằng phương phỏp sốc nhiệt.
- Lấy tế bào khả biến trong tủ -85oC, để trờn đỏ 20-30 phỳt.
- Cho 5 àl pCR 2.1-TYR vào ống eppendorf chứa 50 àl tế bào khả biến và giữ trờn đỏ 30 phỳt.
- Cỏc dũng tế bào được hoạt húa trờn mụi trường LB lỏng cú bổ sung ampicillin 100àg/ml.
- Khõu tỏch chiết thụng qua 3 bước cơ bản sau: (1) phỏ màng tế bào bằng chất tẩy mạnh như SDS, NaOH.
- Nuụi cấy cỏc tế bào vi khuẩn mang plasmid trong mụi trường LB lỏng cú bổ sung chất chọn lọc Amp (100 àg/ml), lắc qua đờm ở 370C, tốc độ 200 vũng/phỳt.
- Ly tõm 10.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, thu sinh khối tế bào • Bổ sung 150 àl dung dịch số 1 (50mM Tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH 8.
- vortex đồng nhất tế bào.
- Vector đó được mở vũng thực hiện trao đổi chộo với genom của Pichia pastoris trong quỏ trỡnh biến nạp, vector được gắn vào tế bào chủ.
- Chuẩn bị tế bào khả biến.[11.
- Giữ tế bào trờn đỏ, chuẩn bị biến nạp.
- Do đú để cú thể thực hiện biểu hiện gen, chỳng tụi tiến hành tỏch ARN tổng số theo phương phỏp Trizol.
- Tế bào được thu sinh khối, phỏ màng bằng cỏc dung dịch chứa SDS, NaOH..và tủa ADN plasmid bằng ethanol.
- Thiết kế vector biểu hiện tyrosinase ở Pichia pastoris X33 • Phõn tớch lựa chọn enzym cắt giới hạn.
- Việc chọn vector biểu hiện là khõu khỏ quan trọng, đảm bảo mục đớnh và hạn chế cỏc cụng đoạn sau lờn men.
- 62 • Thiết kế mồi biểu hiện TYR trong Pichia pastoris.
- Trờn kết quả chọn enzym cắt giới hạn, chỳng tụi thiết kế mồi biểu hiện sao cho gen TYR được treo hai vị trớ cắt EcoR I ở đầu 5’ và Xba I ở đầu 3’, phự hợp và đảm bảo cho việc thiết kế vector biểu hiện.
- Mồi biểu hiện cho TYR Tờn mồi Trỡnh tự Tm (oC) TYRECOR EcoR I 5’ GGAATTCATGGCCTCAGTCGAACCCATC 3’ 68 TYRXBA Xba I 5’ CTCTAGACTATCTCATAGTTCCCACGGTAA 3’ 58 Tiến hành PCR gen TYR với cặp mồi biểu hiện.
- Sản phẩm PCR với mồi biểu hiện trờn gel agarose 1% Trờn bản điện di gel agarose, sản phẩm PCR với mồi biểu hiện cú băng so với ADN chuẩn cú kớch thước mong muốn.
- Đường chạy 1: Sản phẩm PCR bằng mồi biểu hiện 63 hiện là thành cụng.
- Sản phẩm PCR được sử dụng để cài vào vector pPICZαA, thiết kế vector biểu hiện pPICZαA-TYR, biểu hiện trong Pichia pastoris.
- Sơ đồ vector biểu hiện gen TYR trong Pichia pastoris Vector biểu hiện được biến nạp vào E.coli Top 10F’ và chọn lọc trờn mụi trường LB đặc cú nồng độ Zeocin 25μg/ml.
- Vector biểu hiện được biến nạp vào E.coli Top10F’ bằng phương phỏp sốc nhiờt.
- Khuẩn lạc Ecoli Top10F’ mang vector biểu hiện Hỡnh 3.11.
- Điện di đồ AND plasmid biểu hiện vào E.coli Top 10F’ Qua kết quả điện di, trong 12 khuẩn lạc chọn ngẫu nhiờn đem nuụi và tỏch ADN plasmid thỡ cú 7 khuẩn lạc đường chạy chậm hơn là đường chạy của 5 khuẩn lạc khỏc .
- Kết quả trỡnh tự cho thấy việc thiết kế vector biểu hiện pPICZαA-TYR là thành cụng.
- Biến nạp pPICZαA-TYR vào Pichia pastoris X33 P.pastoris X33 là tế bào chủ nấm men cú nhiều ưu điểm trong việc nghiờn cứu chủng tỏi tổ hợp.
- Cắt mở vũng vector biểu hiện bằng Sac I Vector pPICZαA và pPICZαA-TYR được cắt mở vũng bằng enzym cắt giới hạn Sac I, phản ứng được tiến hành ở 370C, qua đờm.
- Chủng Pichia pastoris X33 được nuụi cấy trờn mụi trường YPD, chuẩn tế bào khả biến và biến nạp.
- Điều này cho thấy quỏ trỡnh biến nạp kộm, cú thể so nguyờn nhõn chủng yếu hoặc vector khụng vào được tế bào chủ nờn bị loại bởi chất 1 2 3 4 Đường chạy 1: pPICZαA Đường chạy 2: pPICZαA mở vũng.
- Cỏc khuẩn lạc mọc ớt, chỳng tụi tiến hành nuụi trờn mụi trường biểu hiện BMGY ( Buffered glycerol complex medium) và BMMY (Buffered methanol complex medium) để biểu hiện hoạt tớnh của tyrosinase.
- Vỡ thời gian cú hạn nờn luận văn chưa thể hoàn thiện, tạm dừng ở khõu biến nạp vào tế bào chủ.
- Thiết kế thành cụng vector biểu hiện pPICZαA-TYR (5,2kb) mang gen TYR mó húa tyrosinse từ Aspergillus oryzae TP01.
- Tiếp tục biến nạp vector biểu hiện vào Pichia pastoris X33, tạo chủng tỏi tổ hợp mang gen mó húa tyrosinase

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt