- 23 1.6.2.Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng. - 26 2.1.2.Các kháng thể sử dụng. - 28 2.2.1.Phương pháp sản xuất kháng thể. - 28 2.2.2.Phương pháp tinh sạch kháng thể kháng AFB1 bằng protein A. - 30 2.2.6.Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng. - Nghiên cứu tạo kháng thể kháng AFB1. - 33 3.1.2.Nghiên cứu tinh chế kháng thể đa dòng kháng AFB1. - 34 3.1.3.Đánh giá đặc tính của kháng thể kháng AFB1 tinh sạch. - 39 3.2.3.Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai. - Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng. - Phổ điện di protein tinh sạch kháng thể kháng AFB1. - Đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB1 tinh sạch. - Xác định hàm lượng kháng thể kháng AFB1 cộng hợp với GNPs thích hợp. - Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng. - Phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. - Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng. - Tối ưu hóa hàm lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra (vạch T. - Xác định hàm lượng kháng thể cố định trên vạch kiểm chứng. - Phương pháp này dựa vào tính đặc hiệu của sự gắn kết giữa các kháng thể và kháng nguyên. - Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, tuy nhiên cần sử dụng kháng thể và kháng nguyên có độ tinh khiết cao. - kháng thể kháng kháng thể cộng hợp sẽ được cố định trên thanh que thử tại vị trí kiểm chứng (C-line). - Miếng cộng hợp chứa phức cộng hợp giữa kháng thể kháng aflatoxin với hạt nano vàng. - Nhỏ dung dịch mẫu đã được chuẩn bị vào vị trí miếng thấm mẫu, khi đó dịch mẫu lỏng sẽ thấm từ miếng thấm mẫu sang miếng cộng hợp chứa phức cộng hợp kháng thể kháng aflatoxin và hạt nano vàng. - Do kháng thể cộng hợp bị giữ lại nên các hạt nano vàng cũng bị giữ lại theo và tạo thành một vạch tín hiệu màu hồng tía. - Phức AF-Ab-GNP tiếp tục di chuyển đến vị trí C và bị bắt giữ bởi kháng thể kháng kháng thể cộng hợp tạo thành một vạch tín hiệu màu hồng tía. - Liên kết cộng hóa trị: Ở phương pháp này, kháng thể gắn lên bề mặt vàng bằng liên kết cộng hóa trị. - Miếng cộng hợp Miếng cộng hợp được đặt ở vị trí cầu nối giữa miếng thấm mẫu và màng nitrocellulose được sử dụng để cố định cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng. - Các kháng thể sử dụng 2.1.2.1. - Kháng thể cho tạo que thử - Kháng thể cộng hợp (KT1): kháng thể kháng AFB1 trong nghiên cứu này. - Kháng thể ở vạch kiểm chứng: kháng thể kháng – kháng thể thỏ có nguồn gốc từ dê (Vector Lab, US). - Kháng thể cho ELISA và Dot-blot a. - Kháng thể đơn dòng sơ cấp - Kháng thể đặc hiệu với AFB1 có nguồn gốc từ thỏ trong nghiên cứu này. - Kháng thể thứ cấp - Kháng thể kháng–kháng thể IgG thỏ đánh dấu HPR (Horseaddish peroxidase antibody) (Sigma. - Kháng thể kháng–kháng thể IgG thỏ đánh dấu AP (Alkaline phosphatase) (Sigma). - Phương pháp sản xuất kháng thể Thỏ cái khỏe mạnh được cách ly, kiểm tra thỏ 10 ngày trước tiêm. - Kháng thể (IgG) được thôi ra khỏi cột bằng dung dịch 0,1M glycine, pH 2,7. - Nhỏ 100 µl kháng thể đã pha loãng, mỗi nồng độ 2 giếng. - Nhỏ 100 µl kháng thể 2 (kháng thể kháng thỏ cộng hợp HRP) đã pha loãng 1:30000 lần. - Phương pháp Dot – blot Phương pháp này giúp kiểm tra khả năng gắn kháng thể tinh sạch nghiên cứu trong bài với AFB1-BSA so sánh với kháng thể thương mại. - Ủ kháng thể 1 là kháng thể kháng AFB1 tinh sạch qua đêm ở 10oC. - 31 - Ủ kháng thể 2 là anti rabbit IgG - Alkaline Photphatase tạo ra ở dê trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. - Trong trường hợp kháng thể kháng AFB1 gắn được với AFB1-BSA, kháng thể 2 sẽ gắn vào kháng thể kháng AFB1. - Nếu hiệu suất gắn kháng thể kháng AFB1 với AFB1-BSA càng cao thì màu xuất hiện sẽ càng đậm. - Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng Trong nghiên cứu này, kháng thể kháng AFB1 được gắn lên bề mặt hạt nano vàng dựa trên sự hấp phụ vật lý. - Kháng thể sau khi đã tinh sạch được nhỏ vào dung dịch chứa các hạt nano vàng ở pH thích hợp. - Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng Việc tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng được thực hiện theo Zhang et al, 2009. - 32 - Kháng thể được thêm vào dung dịch trên, trộn nhanh và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 90 phút. - Phần tủa chính là các hạt vàng đã gắn kháng thể và được block bằng BSA. - Phương pháp chuẩn bị miếng cộng hợp Miếng cộng hợp được tạo ra bằng cách nhỏ 10 µl dung dịch tạo cộng hợp giữa kháng thể - hạt vàng lên trên bề mặt miếng vật liệu kích thước 3 x 4 mm. - Nghiên cứu tạo kháng thể kháng AFB1 3.1.1. - Kết quả sắc ký ái lực tinh sạch kháng thể IgG thỏ được thể hiện trong sắc ký đồ Hình 3.2. - Dịch kháng thể thu được sau tinh sạch được bảo quản ở -20oC. - (a) Đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB1 tinh sạch (Anti-AFB1) với AFB1-BSA bằng ELISA (Anti-KLH: kháng thể kháng KLH, Anti-AFB1: kháng thể kháng AFB1. - Các phản ứng tạo màu tạo ra chỉ khi kháng thể 1 (kháng thể kháng AFB1) gắn đặc hiệu với kháng nguyên AFB1-BSA. - Tất cả những điều này chứng minh rằng kháng thể kháng AFB1 tinh sạch do nhóm nghiên cứu tạo ra chỉ bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên AFB1-BSA. - Kết quả cho thấy kháng thể kháng AFB1 do nhóm nghiên cứu tạo ra có chất lượng tốt và tương đương với kháng thể kháng AFB1 chuẩn, hoàn toàn có thể ứng dụng trong chế tạo que thử cũng như các nghiên cứu cần sử dụng. - 1,0 µg kháng thể kháng AFB1 tinh sạch được cộng hợp với hạt nano vàng để tạo miếng cộng hợp, sấy khô và ghép que thử. - Miếng cộng hợp và màng cố định kháng thể được sấy ở 37oC trong 30 phút. - Trong nghiên cứu chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ kháng nguyên tại vị trí kiểm tra trước sau đó mới tối ưu kháng thể kháng thỏ tại vị trí kiểm chứng. - Xác đinh hàm lượng kháng thể kháng AFB1 cộng hợp với hạt nano vàng Kháng thể kháng AFB1 có vai trò bắt giữ kháng nguyên AFB1 trong mẫu. - Hàm lượng kháng thể kháng AFB1 có liên quan mật thiết đến ngưỡng phát hiện và hiển thị tín hiệu của que thử. - Để lựa chọn hàm lượng kháng thể kháng AFB1 thích hợp cộng hợp với hạt nano vàng, chúng tôi tiến hành khảo sát ở 7 nồng độ 40 kháng thể khác nhau, gồm: 1000 ng. - a) Màu sắc của dịch cộng hợp ở các hàm lượng kháng thể khác nhau. - b) Que thử với các hàm lượng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng khác nhau. - c) Kiểm tra đồng thời mẫu âm tính và dương tính (5ppb) ở nồng độ kháng thể trong miếng cộng hợp là 5ng. - Kết quả trên Hình 3.6a cho thấy màu sắc của phản ứng cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng thay đổi khác nhau khi hàm lượng kháng thể thay đổi. - Ở hàm lượng kháng thể 100 ng và 50 ng, màu của phản ứng cộng hợp bị đen đi chứng tỏ một lượng lớn hạt vàng đã bị oxy hóa. - Kết quả Hình 3.6b cho thấy tất cả các que thử đều xuất hiện 1 vạch màu hồng tía với cường độ giảm theo hàm lượng 41 kháng thể. - Nhóm nghiên cứu thấy rằng ở hàm lượng kháng thể chỉ 1 ng vẫn cho một vạch tín hiệu mờ chứng tỏ kháng thể đã hấp phụ lên bề mặt hạt vàng. - Vạch tín hiệu có thể quan sát rõ hơn bằng mắt thường ở hàm lượng kháng thể kháng AFB1 là 5 ng/phản ứng/que thử. - Kết quả thể hiện trên Hình 3.6c cho thấy, ở mẫu âm tính xuất hiện 1 vạch tín hiệu quan sát rõ ràng, do kháng thể kháng AFB1 bắt cặp với kháng nguyên AFB1-BSA phun trên màng Nitrocellulose. - Điều này chứng tỏ với hàm lượng kháng thể kháng AFB1 là 5 ng/phản ứng/que thử, que thử đã hoạt động có hiệu quả. - Vì thế chúng tôi sử dụng hàm lượng kháng thể là 5 ng để tạo cộng hợp cho các nghiên cứu tiếp theo. - Xác định giá trị pH thích hợp tạo cộng hợp Như đã trình bày ở mục 2.2.6, chiến lược gắn kháng thể kháng AFB1 lên bề mặt hạt nano vàng mà nhóm nghiên cứu lựa chọn là hấp phụ vật lý. - Theo nghiên cứu trước đây cũng cho thấy kháng thể (IgG) có giá trị điểm đẳng điện nằm trong khoảng 6,5 - 9,5. - Ngược lại, trong khoảng pH phù hợp, dung dịch cộng hợp vàng - kháng thể có màu đỏ tía. - Để xác định giá trị pH thích hợp đối với kháng thể kháng AFB1 được sử dụng trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng tạo cộng hợp ở các điều kiện pH khác nhau gồm 7,0. - Ngược lại, liên kết của kháng thể kháng AFB1 và bề mặt hạt nano vàng bởi các tương tác ion, tương tác kỵ nước và lực Van der Waals ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ thấp. - Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng, phản ứng tạo cộng hợp đã được tiến hành ở ba nhiệt độ khác nhau (4oC, 25oC và 37oC). - Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 43 Hình 3.8. - Kết quả cho thấy trong cả ba điều kiện nhiệt độ đều xuất hiện vạch tín hiệu với cường độ tín hiệu quan sát được bằng mắt thường, tuy nhiên tín hiệu rõ nhất được quan sát ở điều kiện 25oC (Hình 3.8), do đó điều kiện nhiệt độ này được lựa chọn để tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng cho các nghiên cứu tiếp theo. - Xác định thời gian phản ứng giữa kháng thể và hạt nano vàng Quá trình hấp phụ vật lý xảy ra gồm các giai đoạn: hấp phụ, cân bằng, và giải phấp phụ. - Càng kéo dài thời gian nữa sẽ dẫn đến hiện tượng nhả hấp phụ, kháng thể không còn hấp phụ lên bề mặt hạt nano vàng. - Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng, chúng tôi tiến hành phản ứng tạo cộng hợp với thời gian như sau: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút. - Để rút ngắn thời gian, chúng tôi lựa chọn thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng là 30 phút cho các nghiên cứu tiếp theo. - Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng 3.2.2.5. - Xác định đệm hòa tan cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng nhờ các liên kết vật lý có độ bền không cao. - Chính vì thế trong đệm cộng hợp cần có các thành phần bảo vệ liên kết và kháng thể để ổn định kháng thể, giúp que thử hoạt động bình thường và kéo dài hạn sử dụng. - Xác định nhiệt độ sấy cố định kháng thể lên miếng cộng hợp Việc cố định cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng trên vật liệu cộng hợp là điều cần thiết để tạo miếng cộng hợp hoàn chỉnh. - Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 3.2.3.1. - Nó được dùng để cố định kháng nguyên tại vạch kiểm tra và kháng thể tại vạch đối chứng. - Tốc độ và độ đồng đều của dòng chảy ở màng lai trong que thử sẽ ảnh hưởng đến thời gian và khả năng tương tác giữa kháng thể và kháng nguyên chảy qua. - Tối ưu hóa hàm lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra 3.2.3.3. - Xác định nhiệt độ xử lý màng lai Màng nitrocellulose sau khi được phun sẽ được sấy khô để cố định kháng thể. - Xác định hàm lượng kháng thể cố định trên vạch kiểm chứng lên màng lai Kháng thể thỏ ở vạch kiểm chứng có vai trò bắt giữ kháng thể kháng AFB1 trong cộng hợp nano vàng và có vai trò quan trọng trong việc đánh giá hoạt động bình thường của que thử. - Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các hàm lượng kháng thể thỏ cố định lên vạch kiểm chứng: 0,05 μg. - Xác định hàm lượng kháng thể cố định trên vạch kiểm chứng Kết quả cho thấy khi hàm lượng kháng thể tăng thì cường độ tín hiệu cũng tăng lên rõ rệt (Hình 3.19). - Vì vậy, hàm lượng kháng thể là 0,1 μg được sử dụng để tạo cộng hợp cho các nghiên cứu tiếp theo. - Xác định được điều kiện thích hợp để tạo cộng hợp kháng thể kháng AFB1 với hạt nano vàng: hàm lượng kháng thể 5 ng. - Xác định được điều kiện thích hợp cố định kháng thể lên màng lai: Hàm lượng AFB1-BSA 0,1 µg
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt