- 13 1.1.3.Vai trò, ứng dụng của AChE trong nghiên cứu phát hiện chất độc phốt pho hữu cơ Nhân dòng, biểu hiện acetylcholinesterase. - 17 1.2.1.Nhân dòng, biểu hiện AChE. - Gắn gen mã hóa enzym AChE vào vector biểu hiện. - Kiểm tra biểu hiện AchE bằng SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch. - Phương pháp tối ưu điều kiện biểu hiện AChE trong E.coli. - Nghiên cứu tạo vector tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa acetylcholinesterase trên E. - Xây dựng vector biểu hiện pET43a-AchE. - Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa acetylcholinesterase trên E. - 51 3.2.1.Kiểm tra biểu hiện gen mã hóa acetylcholinesterase trên E. - 67 6 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Trung tâm hoạt động của AChE. - 12 Hình 1.2: Mô phỏng cấu trúc bậc bốn của TcAChE. - 13 Hình 1.3: Mô hình động học tối thiểu của xúc tác AChE. - 13 Hình 1.4: Ảnh hưởng của chất độc cơ phốt pho tới enzym AChE. - 16 Hình 1.5: Nguyên tắc của bộ cảm biến sinh học OP dựa trên sự ức chế AChE. - 17 Hình 1.6: Quy trình nhân dòng và biểu hiện AChE của bò. - 19 Hình 1.7: So sánh hoạt tính của enzym DmAChE tái tổ hợp trước và sau khi tối ưu codon qua các mốc thời gian nuôi cấy. - 22 Hình 1.8: Chỉ số CAI của hBChE trước và sau khi tối ưu trong nấm men Pichia pastoris. - 23 Hình 1.9: Vector pET43a. - 26 Hình 1.10 : Trình tự vector pET 43a. - 27 Hình 1.11: Quy trình biểu hiện enzym AChE tái tổ hợp. - 28 Hình 2.1: Chu trình nhiệt PCR. - 31 Hình 3.1: Chỉ số CAI của cADN AChE bò (Bos taurus) nếu biểu hiện trong E. - 42 Hình 3.2: Chỉ số CAI của cADN AChE bò sau tối ưu hóa codon nếu biểu hiện trong E.coli Hình 3.3: PCR kiểm tra cặp mồi sau khi thiết kế với plasmid pGEMT-AChE. - 44 Hình 3.4: Đĩa khuẩn lạc E.coli DH5α trên đĩa LB có bổ sung Amp. - 45 Hình 3.5: PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv. - 46 Hình 3.6: Kiểm tra khuẩn lạc 1 và 2 với cặp mồi M13 Fw/Rv. - 46 Hình 3.7: Ảnh điện di kết quả tách plasmid pTOP-AChE. - 47 Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pTOP – AChE với enzym giới hạn NdeI và XhoI. - 48 Hình 3.9: Ảnh điện di kết quả tách plasmid pET 43a. - 48 Hình 3.10: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pET43a với enzym giới hạn NdeI và XhoI. - 49 Hình 3.11: Đĩa khuẩn lạc E. - 50 7 Hình 3.12: PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv. - 50 Hình 3.13: Đĩa khuẩn lạc E. - 52 Hình 3.14: PCR kiểm tra 6 khuẩn lạc với cặp mồi T7/ AChE68. - 52 Hình 3.15: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu hiện AChE ở E. - 53 Hình 3.16: Kết quả điện di tối ưu biểu hiện ở các nồng độ IPTG. - 55 Hình 3.17 : Kết quả điện di tối ưu biểu hiện ở các thời gian cảm ứng. - 56 Hình 3.18: Sắc ký ái lực qua cột His-bind tinh sạch AChE tái tổ hợp. - 57 Hình 3.19: Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) kiểm tra sự biểu hiện của pET43a-AChE ở E. - 58 Hình 3.20: Quy trình tinh sạch enzym AChE tái tổ hợp. - 59 Hình 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của AChE tái tổ hợp. - 64 Hình 3.22: Hoạt độ AChE tái tổ hợp khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau. - 65 Hình 3.23. - 66 Hình 3.24: Đồ thị xác định pH tối thích của AChE. - 67 Hình 3.25: Ảnh hưởng của một số chất độc đến hoạt độ của AChE tái tổ hợp. - 13 Hình 1.2: Mô phỏng cấu trúc bậc bốn của TcAChE 1.1.2. - Hình 1.5: Nguyên tắc của bộ cảm biến sinh học OP dựa trên sự ức chế AChE 1.2. - Nhân dòng, biểu hiện acetylcholinesterase 1.2.1. - Hình 1.6: Quy trình nhân dòng và biểu hiện AChE của bò 20 a. - Chủng tái tổ hợp chứa gen dung hợp bmace-AGα1 sẽ cảm ứng biểu hiện BmAChE trên bề mặt tế bào P.pastoris. - Vector tái tổ hợp được biểu hiện trong Escherichia coli BL21 (DE-3). - Năm 2008, Nicola và cộng sự đã nghiên cứu tính phù hợp sử dụng codon ảnh hưởng đến sự biểu hiện protein [27]. - Kết quả thu được chủng nấm men với mức độ biểu hiện DmAChE tái tổ hợp cao. - Hình 1.7: So sánh hoạt tính của enzym DmAChE tái tổ hợp trước và sau khi tối ưu codon qua các mốc thời gian nuôi cấy 23 Năm 2016, Tian và cộng sự đã biểu hiện thành công butyrylcholinesterase của người (hBChE) sau tối ưu hóa codon trên nấm men Pichia pastoris dòng GS115 [35]. - Hình 1.8: Chỉ số CAI của hBChE trước và sau khi tối ưu trong nấm men Pichia pastoris 1.3. - coli, kết quả thu được như hình 3.1: Hình 3.1: Chỉ số CAI của cADN AChE bò (Bos taurus) nếu biểu hiện trong E. - coli 43 Theo hình 3.1, chỉ số CAI là 0,64 nhỏ hơn 0,8. - Do vậy, cADN AChE bò nếu biểu hiện trong E. - Điều này chứng tỏ gen AChE bò sau khi tối ưu có khả năng biểu hiện trong E. - Hình 3.2: Chỉ số CAI của cADN AChE bò sau tối ưu hóa codon nếu biểu hiện trong E.coli 44 3.1.2. - Xây dựng vector biểu hiện pET43a-AchE a. - Kết quả thu được (Hình 3.3) cho thấy sự có mặt của băng ADN có kích thước 1,8 kb. - Kết quả điện di kiểm tra 4 khuẩn lạc (hình 3.5) cho thấy khuẩn lạc 1 và 2 có xuất hiện băng có kích thước là 1,8kb. - 46 Hình 3.5: PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv M: 1 kb ADN marker. - Hình 3.6: Kiểm tra khuẩn lạc 1 và 2 với cặp mồi M13 Fw/Rv M: 1 kb ADN marker. - Hình 3.9: Ảnh điện di kết quả tách plasmid pET 43a 49 M: 1 kb ADN marker, (1): sản phẩm tách plasmid pET 43a Kiểm tra plasmid pET43a bằng enzym giới hạn XhoI và NdeI. - Kết quả cắt bằng enzym giới hạn được kiểm tra trên gel Agarose 1% (hình 3.10). - Vi khuẩn sau biến nạp được gạt trên đĩa LB có bổ sung Ampicillin (hình 3.11). - 50 Đĩa 1 Đĩa 2 Hình 3.11: Đĩa khuẩn lạc E. - Kết quả sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel Agarose 1% (hình 3.12) Hình 3.12: PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv M: 1 kb ADN marker, 5,6: đối chứng. - coli 3.2.1.Kiểm tra biểu hiện gen mã hóa acetylcholinesterase trên E. - coli Plasmid pET43a-AChE được đem biến nạp vào vi khuẩn biểu hiện E. - Vi khuẩn sau biến nạp được gạt trên đĩa LB có bổ sung kháng sinh Amp và Cm (hình 3.13). - 52 Hình 3.13: Đĩa khuẩn lạc E. - Kết quả sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel Agarose 1% (hình 3.14). - Hình 3.14: PCR kiểm tra 6 khuẩn lạc với cặp mồi T7/ AChE68 M: 1 kb ADN marker, (7,8) đối chứng âm sử dụng khuôn là H2O, 1-6: sản phẩm PCR các khuẩn lạc với cặp mồi T7 9-14: sản phẩm PCR các khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv 53 Kết quả điện di trên gel Agarose cho thấy xuất hiện băng đúng với tính toán lý thuyết. - Nhằm kiểm tra khả năng biểu hiện AChE bằng vector pET 43a ở E. - Kết quả biểu hiện gen AChE được kiểm tra bằng SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (Hình 3.15) cho thấy dịch chiết tế bào BL21-DE3 mang vector pET43a-AChE có chứa băng protein 68 kDa (đường chạy 7, 8, 9, hình 3.15A). - Hình 3.15: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu hiện AChE ở E. - coli BL21 DE3 đã biểu hiện được enzym AChE tái tổ hợp. - Cảm ứng biểu hiện trong 3h và ở 37ºC. - Mẫu được xử lý và điện di SDS-PAGE cho kết quả như hình 3.16 dưới đây: Hình 3.16: Kết quả điện di tối ưu biểu hiện ở các nồng độ IPTG M: Thang chuẩn protein được nhuộm sẵn. - Do đó chúng tôi sử dụng nồng độ IPTG tối ưu cho biểu hiện của AChE từ hồng cầu bò trong nghiên cứu này là ở 0,25 mM. - Tối ưu hóa thời gian cảm ứng Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian cảm ứng đến mức độ biểu hiện của AChE đích, chúng tôi lựa chọn các khoảng thời gian cảm ứng biểu hiện từ: 2 h, 3 h, 5 h và 18 h (hình 3.17). - Hình 3.17 : Kết quả điện di tối ưu biểu hiện ở các thời gian cảm ứng M: Thang chuẩn protein được nhuộm sẵn. - Hình 3.17 cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong mức biểu hiện của AChE ở các khoảng thời gian cảm ứng 2 h, 3 h, 5 h. - AChE tái tổ hợp có trong dịch chiết protein tổng số được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực Dịch chiết tế bào có chứa AChE (dưới dạng AChE-Histag) sau đó được tinh sạch bằng cách cho sắc ký qua cột His-bind (hình 3.18). - Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của protein AChE (Hình 3.19A) cho thấy việc sử dụng cột His-bind để tinh sạch protein AChE thu được hiệu quả tốt bởi vì hầu hết các thành phần protein phức tạp bị loại bỏ hết. - Hình 3.19: Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) kiểm tra sự biểu hiện của pET43a-AChE ở E. - Từ những kết quả nghiên cứu đã thực hiện đưa ra quy trình tinh sạch enzym AChE như hình 3.20 dưới đây. - Hình 3.20: Quy trình tinh sạch enzym AChE tái tổ hợp Thuyết minh quy trình: 60 Bước 1. - Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 9 và hình 3.21. - Hình 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của AChE tái tổ hợp Hình 3.21 cho thấy: khi nhiệt độ tăng dần từ thấp tới cao thì tốc độ phản ứng thủy phân acetylcholine với AChE tăng dần và tăng mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 30-35oC. - 65 Bảng 10: Xác định độ bền nhiệt của AchE Nhiệt độ Hoạt độ tương đối (U/mg Hoạt độ tương đối Hình 3.22: Hoạt độ AChE tái tổ hợp khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau Năm 2010, Assis và cộng sự đã nghiên cứu tính chất của AChE tách chiết từ não cá heo sọc Amazon Colossoma macropomum [3]. - Chúng tôi tiến hành ủ enzym với đệm ở các pH khác nhau trong 30 phút ở 30ºC sau đó tiến hành xác định hoạt độ của AChE còn lại ở điều kiện ban đầu, kết quả được trình bày ở bảng 11, hình 3.23. - Bảng 11: Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của enzym AchE tái tổ hợp pH U/mg hoạt tính tương đối Hình 3.23. - Kết quả thu được (bảng 12, hình 3.24) cho thấy pH tối thích của AChE là 7,4. - 67 Bảng 12: Xác định giá trị pH tối thích của AchE tái tổ hợp pH hoạt tính tương đối U/mg Hình 3.24: Đồ thị xác định pH tối thích của AChE Qua kết quả nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn giá trị pH = 7,4 tối ưu cho các nghiên cứu về tính chất hóa lý của AChE hoặc phân tích chất độc phốt pho hữu cơ bằng AChE. - Kết quả thu được ở hình 3.25: Hình 3.25: Ảnh hưởng của một số chất độc đến hoạt độ của AChE tái tổ hợp Từ kết quả thu được trên hình hoạt độ AChE giảm khi tăng nồng độ chất độc tăng và giá trị IC50 của các chất độc Parathion, methyl parathion, Dipterex, DDVP và OB-S với AChE tái tổ hợp tương ứng là: 3,42µM. - KẾT LUẬN - Đã tối ưu hóa codon, nhân dòng và biểu hiện thành công AChE ở E
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt