- STREPTOCOCCUS INIAE, TÁC NHÂN GÂY BỆNH “ĐEN THÂN”. - TRÊN CÁ RÔ ĐỒNG (ANABAS TESTUDINEUS). - Cá rô đồng (An b s testudineus), bệnh “đen thân”, LD 50 , Streptococcus iniae. - Nghiên ứu mô tả l n đ u tiên phân lập vi khuẩn Strepto o us ini e là tá nhân gây bệnh “đen thân” trên á rô đồng (An b s testudineus). - Nghiên ứu đã thu đ ợ 114 mẫu á rô đồng bệnh ó dấu hiệu đen thân ở á o nuôi thâm nh khá nh u ở á tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. - Qu n sát tế bào vi khuẩn nhuộm Gr m ó hình u, d ng huỗi, Gr m d ng. - ết quả kiểm tr đặ điểm hình thái, sinh lý, sinh hó , k t API 20Strep và giải trình tự gen 16S rRNA đã xá định vi khuẩn phân lập trên á rô đồng bệnh “đen thân” là Strepto o us ini e.. - H i hủng vi khuẩn S. - ini e điển hình đ ợ sử dụng để gây th nghiệm ảm nhiễm trên á rô đồng giống khỏe (tr ng l ợng 3-6 g) bằng ph ng pháp tiêm 4 nồng độ từ 10 3 đến 10 6 CFU/mL. - Giá trị LD 50 đ t đ ợ là là 3,73×10 3 CFU/mL s u 120 h và 2,43×10 5 CFU/ml s u 144h. - Cá rô đồng nhiễm bệnh s u khi gây ảm nhiễm ó dấu hiệu lâm sàng giống với bệnh “đen thân” ngoài o nuôi.. - Cá rô đồng (Anabas testudineus) là loài cá phân bố rộng, có thể sống ở các thủy vực nước ngọt và nước lợ. - Gần đây, cá rô đồng đang là đối tượng nuôi chủ yếu ở các tỉnh như Hậu Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Tiền Giang… Tuy nhiên, việc mở rộng diện tích nuôi cũng như việc thâm canh hóa đối tượng nuôi này đã phát sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm, đặc biệt là dịch bệnh do vi khuẩn. - Trong đó, bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus hiện đang gây nguy hiểm trên nhiều loài cá nuôi và thiệt hại cho nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới hàng năm lên đến 150 triệu đô la (Romalde et al., 2009).Trong nhóm vi khuẩn này, Streptococcus iniae gây bệnh trên nhiều loài cá nước ngọt và lợ. - Theo một số nghiên cứu gần đây đã tìm thấy ít nhất 27 loài cá nuôi và tự nhiên đã nhiễm bệnh do vi khuẩn S. - iniae trên cá rô đồng.. - Bệnh “đen thân” trên cá rô đồng hiện nay gây thiệt hại lớn cho người nuôi, với tỉ lệ hao hụt trên 50%. - iniae gây bệnh “đen thân” trên cá rô là vấn đề cấp thiết và được thực hiện trong nghiên cứu này.. - Mẫu cá rô đồng bệnh “đen thân” được thu từ 20 ao nuôi thâm canh ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. - Tổng số mẫu bao gồm 114 mẫu cá rô đồng có biểu hiện bệnh “đen thân” và 26 cá khỏe trọng lượng 6-200 g, được thu từ các ao nuôi thâm canh ở tỉnh Hậu Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Tiền Giang, cá được thu suốt từ tháng . - Mẫu cá được kiểm tra sức khỏe tổng quát bao gồm ký sinh trùng, nấm và vi khuẩn. - Kiểm tra vi sinh được tiến hành dựa theo cẩm nang của Frerichs và Millar (1993), mẫu gan, thận, tỳ tạng, máu, mắt và não cá bệnh “đen thân” được cấy trên môi trường brain heart infusion agar (BHIA, Merck) và thạch máu (BA: Blood agar, Nam Khoa), được ủ sau 24 - 36h, ở 28°C.. - 2.2 Phân lập và định danh vi khuẩn. - Vi khuẩn phát triển trên môi trường BHI agar và BA được kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản như: nhuộm Gram, tính di động, oxidase, catalase, phản ứng O/F, khả năng dung huyết.. - Định danh vi khuẩn được dựa các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa theo cẩm nang của Cowan và Steel (1993), Frerichs và Millar (1993) và Buller (2004) đồng thời sử dụng bộ kít API 20Strep (BioMerieux, Pháp) với các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất và giải trình tự gen 16S rRNA tra cứu trên ngân hàng Gen bằng chương trình Blast Search tại phòng thí nghiệm Nam Khoa Biotek.. - 2.3 Thí nghiệm cảm nhiễm xác định LD 50. - Vi khuẩn gây cảm nhiễm: Hai chủng S.. - iniae S2FC4 và S8FC1 phân lập từ cá rô bệnh. - “đen thân” tại ao nuôi sử dụng cho thí nghiệm. - cảm nhiễm. - Sau khi vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong Brain-Heart infusion broth (BHIB) trên máy lắc ở 28°C 18-24h, tiến hành ly tâm 13000 vòng ở 4°C trong 10 phút, sau đó rửa lại với dung dịch với nước muối sinh lý (0,85%. - Mật độ vi khuẩn được xác định bằng đo ở bước sóng 620 nm (OD=1 0,02) tương đương mật độ vi khuẩn là 10 8 CFU/mL. - Các mật độ vi khuẩn gây cảm nhiễm trong nghiên cứu này được trình bày ở Bảng 1:. - Bảng 1: Mật độ vi khuẩn sử dụng thí nghiệm cảm nhiễm. - Chủng vi khuẩn Mật độ vi khuẩn (CFU/mL). - iniae S8FC Phương pháp cảm nhiễm: Cá thí nghiệm. - được tiêm vào xoang bụng liều 0.1 mL/cá với mật độ vi khuẩn ở Bảng 1. - Cá lờ đờ hay vừa mới chết được phân lập vi khuẩn ở gan, thận trước, tỳ tạng, máu, mắt và não trên môi trường BHI agar và BA.. - 3 KẾT QUẢ. - Hình 1: A: Cá rô bệnh biểu hiện thân đen sậm, mắt đục và bụng to (mũi tên). - 3.2 Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh Kết quả kiểm tra ngoại và nội ký sinh trùng không thấy sự khác biệt giữa cá bệnh “đen thân” và cá khỏe. - Điển hình như các mẫu cá rô kiểm tra thường xuất hiện trùng bánh xe, Henneguya và sán lá 16 móc Dactylogyrus sp ở mức độ cảm nhiễm thấp (1 - 4 con/lame). - Cá rô đồng nuôi nhiễm nội ký sinh Camallanus sp. - Như vậy, ký sinh trùng trên mang và da cá rô đồng không là tác nhân gây nên bệnh “đen thân”.. - Tổng cộng 97 chủng vi khuẩn được phân lập từ gan, thận, tỳ tạng, máu mắt và não của. - cá bệnh “đen thân” trên môi trường BHI và BA. - Hầu hết đều xuất hiện vi khuẩn thuần sau 24 - 36 h ủ ở nhiệt độ 28°C. - Vi khuẩn phân lập được đều là các tế bào vi khuẩn Gram dương (Hình 2B), dạng chùm trên môi trường thạch và dạng chuỗi hoặc đơn cầu trên môi trường lỏng hay các mẫu máu (Hình 2A). - Kết quả nghiên cứu này tìm thấy vi khuẩn trong các mẫu phân lập thuộc nhóm Streptococcus. - Vi khuẩn phát triển trên môi trường BHI agar và BA sau 24 - 36 h ở 28°C, đường kính khuẩn lạc khoảng 1 mm, màu trắng đục, bề mặt trơn láng. - Vi khuẩn có khả năng dung huyết dạng β trên môi trường thạch máu (Hình 3B) và phát triển trong môi trường NaCl 6.5%, âm tính với Catalase, Oxidase, O/F, không phát triển ở pH 9.6 hay ở nhiệt độ 60 o C (Bảng 2).. - Bảng 2: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn gây bệnh “đen thân” trên cá rô. - iniae phân lập (n= 97). - iniae phếch trên lame, các tế bào vi khuẩn hình cầu và chuỗi tập trung quanh tế bào máu (40X), B: Vi khuẩn S. - Đặc biệt, đối với ribose (RIB), mannitol (MAN), trehalose (TRE), amygdalin (AMD) và glycogen (GLY) bị a-xit hóa (dương tính) bởi các chủng vi khuẩn này.. - Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng trong nghiên cứu này giống với chủng vi khuẩn Streptococcus iniae trong nghiên cứu của Buller (2004) trừ chỉ tiêu arginine hydrolysis (AHD) có thể thay đổi. - Đồng thời kết hợp ứng dụng sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA được tra cứu trên ngân hàng Gen bằng chương trình Blast Search đã khẳng định được vi khuẩn hình cầu là Streptoccus iniae có trình tự gen tương đồng là 100%.. - 3.3 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm LD 50. - Kết quả cảm nhiễm nhân tạo 2 chủng vi. - khuẩn Streptococcus iniae S2FC4 và S8FC1 trên cá rô đã xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng giống với cá rô bệnh “đen thân” ngoài ao nuôi.. - Sau 18 giờ cảm nhiễm, cá thí nghiệm có dấu hiệu bệnh đen thân, bơi lờ đờ và cá chết đã được ghi nhận sau 27 giờ gây cảm nhiễm ở các mật độ 10 6 CFU/mL. - Sau 14 ngày cảm nhiễm, tỉ lệ cá chết trên các chủng vi khuẩn cảm nhiễm S. - iniae S2FC4 và S8FC1ở mật độ 10 6 CFU/ml lần lượt là 60% và 80%. - Trong khi đó, lô đối chứng (không tiêm vi khuẩn S.iniae), cá vẫn hoạt động bình thường trong suốt thời gian thí nghiệm. - Vi khuẩn phân lập được từ cá thí nghiệm cảm nhiễm này được tái định danh cho kết quả giống với kết quả vi khuẩn gây bệnh. - “đen thân” ngoài tự nhiên. - Như vậy, loài vi khuẩn Gram dương, hình cầu S. - iniae là tác nhân gây bệnh “đen thân” trên cá rô đồng. - Qua thí nhiệm này, giá trị LD 50 trên 2 chủng vi khuẩn cảm nhiễm S. - iniae S2FC4 và S8FC1 được xác định lần lượt là 3,73×10 3 CFU/mL sau 120h và 2,43×10 5 CFU/mL sau 144h.. - Trong nuôi trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn Streptococcus là tác nhân gây bệnh của hầu hết các loài cá nuôi và tự nhiên ở vùng nước ngọt, lợ và mặn (Agnew và Barnes, 2007 và Pasnik et al., 2009). - Ở Nhật, vi khuẩn này gây bệnh trên cá hồi Oncorhynchus mykiss được báo cáo đầu tiên năm 1958 do Hoshina at al. - Sau đó, vi khuẩn nguy hiểm này gây bệnh trên nhiều loài cá làm tổn thất lớn về kinh tế (Creeper và Buller, 2006 và Noga, 2010). - Trên cá rô đồng, trong nghiên cứu này lần đầu tiên phân lập được S. - iniae trên cá rô đồng bệnh. - “đen thân”.. - Vi khuẩn S. - iniae phân lập trên cá rô bệnh “đen thân” phát triển ở nồng độ muối 6,5%. - Đây là một đặc điểm sinh học rất đặc biệt của nhóm vi khuẩn này, có liên quan đến khả năng gây bệnh trên nhiều đối tượng nuôi ở cả vùng nước ngọt và mặn (Nagatsugawa, 1983 và Humphrey et al., 1987).. - iniae không có trong cơ sở dữ liệu của các bộ kít định danh vi khuẩn như API 20 Strep, Rapid ID 32 Strep. - Vì thế, chỉ dựa vào kết quả kít này để định danh vi khuẩn S. - Việc ứng dụng sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA là cách tốt nhất trong việc định danh loài vi khuẩn này (Roach et al., 2006 và El Aamri et al., 2010).. - Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm, cá ở các nghiệm thức đối chứng vẫn hoạt động bình thường. - Trong khi các nghiệm thức có tiêm chủng vi khuẩn S. - iniae, cá rô giống nhiễm bệnh và chết có dấu hiệu lâm sàng giống với bệnh “đen thân” ngoài ao nuôi. - Trong thí nghiệm này, giá trị LD 50 trên 2 chủng vi khuẩn trên cá rô đồng tương đối. - Hình 4: Đồ thị tỉ lệ chết gây cảm với 2 chủng S.iniae S2FC4 và S8FC1 (từ trái qua). - 10 6 CFU/ml 10 5 CFU/ml 10 4 CFU/ml 10 3 CFU/ml ĐC. - cao 10 3 và 10 5 CFU/mL. - Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đó trên cá rô phi CFU) (Perera et al., 1997) và cá chẽm (2.0×10 3 CFU) (Bromage và Owens 2002). - Điều này phù hợp với thí nghiệm trước đây của Bromage et al. - (1999), tác giả gây cảm nhiễm trên cá chẽm Lates calcarifer, vi khuẩn S. - Trong khi đó, nghiên cứu của El Aamri et al. - (2010) cho thấy, cá tráp biển Pagrus pagrus nhiễm vi khuẩn S. - iniae có biểu hiện lờ đờ và chết sau 72 giờ ở 10 8 CFU/mL.. - Sự khác nhau thời gian cá chết giữa các nghiên cứu tùy thuộc vào sự mẫn cảm khác nhau của từng loài cá, độc lực của vi khuẩn cũng như các yếu môi trường, đặc biệt là nhiệt độ (Agnew và Barnes, 2007).. - Vi khuẩn Streptococcus iniae Gram dương, hình cầu là tác nhân gây bệnh “đen thân” trên cá rô đồng (Anabas testudineus). - Kết quả cảm nhiễm xác định LD 50 trên 2 chủng vi khuẩn cảm nhiễm S. - iniae S2FC4 và S8FC1 là 3,73×10 3 CFU/mL sau 120h và 2,43×. - 10 5 CFU/mL sau 144h.