NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA TRÊN THẬN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)

- NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA TRÊN THẬN.
- CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS).
- Qui trình PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila nhiễm trên thận cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thực hiện và chuẩn hóa.
- Trong qui trình này mồi xuôi AeroFd và mồi ngược AeroRs được sử dụng để khuếch đại gen Aerolysin của A..
- hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp (Panangala et al., 2007).
- Độ nhạy của qui trình là 100 pg DNA chiết tách từ thận cá tra.
- Tính đặc hiệu của qui trình được kiểm tra với vi khuẩn phổ biến trong thủy sản là Vibrio alginolyticus, V.
- Qui trình có thể ứng dụng để phát hiện nhanh và nhạy A.
- hydrophila nhiễm trên cá tra so với phương pháp sinh hóa truyền thống..
- Nghề nuôi thủy sản ở Việt Nam đang phát triển rất nhanh nhất là nghể nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).
- Do lợi nhuận cao nên diện tích nuôi cá tra tăng rất nhanh với mật độ nuôi cao dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, dịch bệnh xảy ra tràn lan và mầm bệnh ngày càng đa dạng.
- Trong số các bệnh thường gặp ở cá tra thì bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila là bệnh gây nhiều thiệt hại cho người nuôi.
- Tình hình dịch bệnh đòi hỏi phải có một phương pháp chẩn đoán sớm và chính xác mầm bệnh để từ đó có hướng xử lý và điều trị kịp thời.
- Hiện nay phương pháp phát hiện vi khuẩn A.
- hydrophila trên cá tra phổ biến là sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc kit API20E (BioMerieux)..
- Tuy nhiên, phương pháp sinh hóa đòi hỏi nhiều thời gian nên chưa đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán bệnh trong tình hình hiện nay.
- phương pháp PCR chẩn đoán A.
- hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra được thực hiện và ứng dụng dựa trên qui trình PCR phát hiện A.
- Qui trình có giá trị ứng dụng trong việc xác định nhanh và chính xác tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá tra nhằm làm cơ sở cho việc đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh hiệu quả..
- 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu.
- Các chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra bệnh xuất huyết được định danh là A..
- hydrophila bằng kit API 20E được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm cảm nhiễm và chuẩn hóa qui trình PCR.
- Thận cá tra bệnh xuất huyết còn sống lờ đờ từ thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn A.
- hydrophila được thu và trữ trong ethanol (Merck) để chiết tách DNA..
- 2.2 Phương pháp nghiên cứu.
- Phương pháp chiết tách DNA từ vi khuẩn được thực hiện theo Bartie et al.
- Vi khuẩn được nuôi tăng sinh (16-18 giờ ở 28°C) trong 5 ml môi trường nutrient broth (NB).
- Chuyển 1.5 ml dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf mới và cho vào 100 µl dung dịch TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0).
- Ly tâm 2 phút với vận tốc 14000 vòng/phút để tách dung dịch DNA và trữ ở -20°C cho đến khi sử dụng..
- Phương pháp phenol chloroform (Taggart et al., 1992) được sử dụng để chiết tách DNA từ thận cá tra.
- Thận cá (50-100mg) được nghiền nát trong 600l dung dịch Lysis buffer (0.5M NaCl, 0.001 EDTA, 1% SDS, 0.8% Triton, 0.1M Tris-HCl), 40l SDS 10% và 2.5l Proteinase K (40mg/ml).
- Loại bỏ dung dịch phía trên.
- Hàm lượng DNA được xác định bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 260nm..
- Thành phần phản ứng phát hiện A.
- hydrophila được thực hiện dựa theo qui trình của Panangala và ctv (2007) có điều chỉnh gồm 1X dung dịch đệm 10X.
- 0.4 μM mồi ngược (AeroRs) và 20ng mẫu DNA chiết tách từ vi khuẩn A..
- Chu kì nhiệt thực hiện phản ứng là 95 ° C trong 4 phút.
- Thí nghiệm xác định độ nhạy của phản ứng PCR được thực hiện bằng cách pha loãng từ 10 0 (100ng đối với DNA chiết tách từ vi khuẩn A.
- hydrophila, 1000ng đối với mẫu chiết tách từ thận) đến 10 -5 .
- Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR được thực hiện với các loài vi khuẩn phổ biến trong thủy sản là Vibrio alginolyticus, Edwardsiella ictaluri, Escherichia coli, Pseudomonas putida và Vibrio harveyi..
- Sản phẩm PCR 10µl được chạy điện di trên gel 1% agarose (ABgene, UK) trong dung dịch đệm TAE 0.5X (10 mM Tris, 5 mM acetate, 0.1 mM EDTA).
- Kết quả điện di được ghi nhận bằng Gel Doc XR System (Bio-Rad).
- Căn cứ vào thang DNA 1 kb plus (Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử.
- Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu với DNA của vi khuẩn A.
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
- 3.1 Qui trình PCR phát hiện A.
- hydrophila sử dụng DNA chiết tách từ vi khuẩn.
- Qui trình PCR phát hiện A.
- hydrophila được thực hiện bằng cách sử dụng 7 mẫu DNA được chiết tách từ 7 chủng vi khuẩn A.
- hydrophila phân lập từ mẫu cá tra bệnh xuất huyết thu ở các tỉnh Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ (Hình 1)..
- Hình 1: Cá tra có dấu hiệu xuất huyết.
- Hàm lượng DNA sử dụng cho phản ứng PCR của cả 7 mẫu là 20 ng.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR của tất cả các mẫu đều hiện vạch ở vị trí 209 bp (Hình 2).
- Mặc dù trong 7 mẫu thì có những vạch hơi mờ nhưng kết quả cho thấy cặp mồi AeroFd và AeroRs khuếch đại đặc hiệu trên gen Aerolysin của vi khuẩn A.
- hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp.
- Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả của Panangala et al.
- Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A.
- hydrophila sử dụng DNA chiết tách từ 7 chủng A.
- giếng 3: chủng Ae-CA-T.
- chủng Ae-SD-T.
- giếng 5: chủng Ae-CA-TT;.
- giếng 6: chủng Ae-TN-TT.
- giếng 7: chủng Ae-TN-G.
- Giếng 8: chủng Ae-TN-T.
- chủng Ae-SD-TT.
- Độ nhạy của qui trình PCR phát hiện A.
- hydrophila được xác định sử dụng DNA chiết tách từ vi khuẩn chủng Ae-SD-TT.
- Kết quả cho thấy qui trình có thể phát hiện A.
- hydrophila ở hàm lượng DNA khuôn là 100 pg (Hình 3).
- Từ kết quả cho ta thấy qui trình có độ nhạy rất cao cho phép phát hiện được A.
- hydrophila ở hàm lượng rất thấp, từ đó có thể thực hiện qui trình PCR phát hiện A.
- hydrophila trực tiếp từ DNA chiết tách từ thận cá tra..
- Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định độ nhạy của qui trình phát hiện A.
- hydrophila sử dụng DNA chiết tách từ chủng vi khuẩn Ae-SD-TT.
- 3.2 Qui trình PCR phát hiện A.
- hydrophila sử dụng mạch khuôn chiết tách từ vi khuẩn.
- Qui trình PCR phát hiện A.hydrophila được sử dụng để phát hiện mẫu thận cá nhiễm khuẩn bằng cách chọn ngẫu nhiên 2 mẫu DNA chiết tách từ thận cá được tiêm chủng A.
- Hàm lượng DNA sử dụng cho phản ứng PCR là 100 ng.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy 2 mẫu đều hiện vạch ở 209bp (Hình 4)..
- Hình 4: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A.
- hydrophila sử dụng DNA chiết tách từ thận cá bị xuất huyết.
- Kết quả xác định độ nhạy của qui trình PCR sử dụng DNA chiết tách từ thận cá tra (AeC2) cho thấy qui trình có thể phát hiện A.
- hydrophila ở hàm lượng DNA khuôn là 1ng (Hình 5)..
- Hình 5: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định độ nhạy của qui trình phát hiện A.
- hydrophila sử dụng DNA chiết tách thận cá bệnh xuất huyết.
- Tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện A.
- hydrophila được kiểm tra bằng cách sử dụng DNA chiết tách từ 5 loại vi khuẩn thường gặp trong thủy sản là Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, Edwardsiella ictaluri, Escherichia col và Pseudomonas putida.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 6) cho thấy chỉ có mẫu A.
- hydrophila (Giếng 2) mới cho sản phẩm PCR hiện vạch ở vị trí 209 bp còn các mẫu còn lại thì không hiện vạch.
- Điều này chứng tỏ qui trình đặc hiệu để phát hiện A.
- Hình 6: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của qui trinh phát hiện A.
- hydrophila sử dụng DNA chiết tách từ các loài vi khuẩn thường gặp trong thủy sản.
- Qui trình có thể phát hiện được A.
- hydrophila sử dụng DNA chiết tách từ vi khuẩn ở hàm lượng DNA khuôn là 100 pg.
- Ngoài ra, qui trình còn có thể phát hiện A..
- hydrophila ở hàm lượng DNA khuôn là 1ng khi sử dụng DNA chiết tách từ thận cá.
- Qui trình đặc hiệu với vi khuẩn A.
- hydrophila và có triển vọng ứng dụng tốt để phát hiện A.
- hydrophila trên mẫu cá tra thu ở ao nuôi..
- Ứng dụng REP-PCR và PFGE để định týp vi khuẩn kháng