- TẠO DÒNG BIỂU HIỆN malQ TỪ ESCHERICHIA COLI K12 VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA. - ENZYM MalQ. - The gene of malQ encoding 4-α-glucanotransferase (amylomaltase) is located in the malPQ operon of Escherichia coli K12. - The optimal reaction condition of MalQ was at 37°C, in 200 mM sodium acetate buffer, pH 6.5.. - Title: Cloning malQ from Escherichia coli K12 and Determination of Optimal Reaction Condition of MalQ. - Gen malQ giải mã enzym 4-α-glucanotransferase (amylomaltase) được định vị trong malPQ operon của Escherichia coli K12. - Gen malQ có 2082 nucleotide mã hóa 694 amino acid hình thành protein có trọng lượng phân tử là 72 kDa. - Để tìm hiểu đặc tính của enzym này từ E. - coli, MalQ được biểu hiện bằng cách biến nạp trong vector pET29b.. - Điều kiện hoạt động tối thích của enzym MalQ được xác định ở nhiệt độ 37°C, pH 6.5 trong dung dịch sodium acetate 200 mM.. - Trong tế bào chất, MalQ được biểu hiện với glucan phosphorylase và cả hai có vị trí trên cùng operon.. - Protein này được xác định là thành phần của hệ thống vận chuyển và sử dụng maltooligosaccharide [4]. - Để hiểu và xác định đặc tính của MalQ, “Tạo dòng biểu hiện malQ từ Escherichia coli K12 và xác định điều kiện hoạt động tối ưu của enzym MalQ” được thực hiện.. - sử dụng làm vật chủ cho biểu hiện dòng gen. - 2.2 Tạo dòng gen malQ ở E.coli K12. - Dựa vào trình tự gen malQ của E. - coli K12 trong ngân hàng gen, cặp mồi malQ- NdeI R (5’-AAACGCTAAGGAAGCCATATGGAAAGC-3’) và malQ-XhoI F (5’-AACCGCACTCTCGAGCTTCTTCGCTGCAGC-3’) được thiết kế để dùng cho PCR. - Thành phần phản ứng PCR gồm 100 µl trong đó dung dịch đệm [10 mM Tris/pH 8.85. - Sản phẩm PCR được được tinh sạch bằng QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Germany) và cắt bằng NdeI và XhoI. - Đoạn gen malQ được nối vào vector pET-29(+)(T7 promoter, N-terminal His 6 tag, Kan r , Novagen Inc., Madison, Wis.) tại NdeI và XhoI nhờ T4 DNA ligase. - Thành phần phản ứng nối gồm plasmid pET29-malQ[His] và gen malQ. - Sản phẩm nối sau đó được biến nạp vào E. - 2.3 Sản xuất và tinh sạch MalQ. - Các khuẩn lạc dự tuyển được kiểm chứng bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi malQ-NdeI R và malQ-XhoI F của gen malQ. - Biến nạp pET29-malQ vào E.coli BL21 (DE3). - Chủng biểu hiện sau khi biến nạp được nuôi ở 37°C trong môi trường Luria-Bertani (LB) lỏng hoặc LB agar có bổ sung 20 µg/ml kanamycin. - Sự biểu hiện của gen được điều tiết bằng cách thêm isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). - Protein mục tiêu được thẩm tách lại trong dung dịch đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.5. - Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford [3]. - 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo dòng biểu hiện gen malQ từ E. - coli K12. - coli K12 bằng PCR (Hình1). - tích trình tự DNA (Biomedic-Korea) xác định không có sai sót trong suốt quá trình PCR.. - Cột 1: sản phẩm PCR. - 3.2 Cấu trúc cơ bản của gen malQ. - Khung đọc mở gen malQ bắt đầu bằng start codon ATG ở nucleotide 3,292 và kết thúc với TAG codon ở nucleotide 1,208 giải mã chuỗi polypeptide đơn của 694 amino acid (Hình 2).. - Hình 2: Trình tự chuỗi nucleotide của gen malQ Trình tự protein dự đoán được trình bày bên dưới trình tự DNA. - 3.3 Biểu hiện và tinh sạch MalQ tái tổ hợp. - coli được giải mã bởi gen malQ hợp nhất với C-terminal His 6 tag của vector pET29b và biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter T7. - Gen biểu hiện sẽ được điều tiết bằng cách bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 0.2 mM được xem là thích hợp ở mức hấp thu quang học đạt đến 0.6 (đo ở 600 nm). - Sản phẩm MalQ tạo ra trong E.coli được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực Ni-NTA. - Kết quả hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp Lugol’s [5] (Bảng 1) cho thấy enzym được tinh sạch 3 lần, với sản lượng đạt được là 20% trong quá trình tinh sạch một bước và trọng lượng phân tử tương đương 72 kDa (Hình 3) tương quan với trọng lượng phân tử dự đoán từ trình tự amino acid của MalQ.. - Hình 3: Phân tích SDS-PAGE của MalQ tái tổ hợp được biểu hiện từ pET29b trong E. - Cột 2: MalQ sau khi tinh sạch Bảng 1: Hoạt tính và hàm lượng protein của enzym MalQ qua các bước tinh sạch. - Bước tinh sạch. - Hoạt tính tổng. - Hoạt tính riêng (mU/mg). - Độ tinh sạch. - 3 3.4 Đặc tính của enzym MalQ. - Tốc độ phản ứng của MalQ tăng dần và đạt tối đa ở nhiệt độ 37°C, nhưng sau đó hoạt tính của enzym giảm nhanh ở nhiệt độ trên 40°C. - Vì vậy, nhiệt tối thích cho hoạt động của MalQ tái tổ hợp là 37°C khi 0.05% (w/v) amylose trong 200 mM sodium acetate bufer (pH 6.5) được sử dụng làm cơ chất (Hình 4).. - Hình 4: Nhiệt độ tối ưu của MalQ 97. - Nhiệt độ (°C). - Hoạt tính tương đối. - Để xác định pH tối ưu của MalQ, hoạt tính tương đối của MalQ với amylose được đo qua một loạt pH từ 4 đến 10. - Dung dịch đệm được sử dụng như sau: 50 mM sodium acetate (pH 4.0 đến 6.0). - 200 mM sodium acetate (pH 4.0 đến 6.5). - 50 mM sodium phosphate (pH 6.5 đến 8.0). - and 50 mM Tris-HCl (pH 6.5 đến 10) (Hình 5). - Enzym MalQ hoạt động tốt nhất ở pH 6.5 với 0.05% (w/v) amylose trong môi trường 200 mM sodium acetate. - ngược lại hoạt tính của nó khá thấp trong dung dịch đệm 50 mM sodium acetate.. - Hình 5: pH tối ưu của MalQ. - Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm sodium acetate trên hoạt tính của MalQ pH. - 120 50 mM Tris-HCl. - 50 mM Na-phosphate 50 mM Na-acetate 200 mM Na-acetate. - Nồng độ (mM). - Hình 7: Ảnh hưởng của ion sodium trên hoạt tính của MalQ. - Hoạt tính của enzym MalQ không bị ưc chế bởi nồng độ ion sodium cao. - Khi nồng độ sodium chloride được tăng lên từ 200 mM đến 500 mM trong dung dịch đệm 50 mM sodium acetate, hoạt tính của enzym này chỉ thay đổi 11% (Hình 6 và 7).. - Với “tạo dòng biểu hiện malQ từ Escherichia coli K12 và xác định điều kiện hoạt động tối ưu của enzym MalQ” bước đầu cung cấp các dữ liệu và thông tin cơ bản cho các nghiên cứu về đặc tính xúc tác của enzym này đồng thời giúp tìm hiểu sâu hơn vai trò của nó trong hệ thống chuyển hóa maltodextrin/glycogen của E. - Maltose/maltodextrin system of Escherichia coli:. - Maltose and maltotriose can be formed endogenously in Escherichia coli from glucose and glucose-1- phosphate independently of enzymes of the maltose system. - Purification and characterization of a novel thermostable 4-α-glucanotransferase of Thermotoga maritima cloned in Escherichia coli