- NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ SẸO CÓ KHẢ NĂNG SINH PHÔI VÀ MÔ PHÔI SOMA SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.). - TÓM TẮT: Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu về tạo và nuôi nhân mô sẹo có khả năng sinh phôi soma từ mô sẹo lá trong môi trường lỏng. - tạo mô phôi soma từ mô sẹo có khả năng sinh phôi, sự phát sinh hình thái chồi/rễ của mô phôi soma trong nuôi cấy và nuôi nhân phôi soma Sâm ngọc linh trong môi trường lỏng. - Mảnh lá (0,5 x 0,5 cm) được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo MS có 2 mg/l 2,4-D. - Mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường MS + 1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,2 mg/l kinetin + 10% nước dừa để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi và môi trường MS½ + 0,2 mg/l 2,4-D + 10% nước dừa để tạo mô phôi. - Mô sẹo có khả năng sinh phôi tăng nhanh sinh khối qua nuôi cấy trong môi trường lỏng MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l NAA. - Mô phôi có khả năng tăng sinh nhanh trong môi trường lỏng MS½ + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l BA. - Tùy môi trường nuôi cấy ban đầu và ở các giai đoạn tiếp theo, mô phôi phát triển theo hướng tạo chồi hoặc rễ tạo quần thể chồi hoặc rễ. - Từ khóa: Panax vietnamensis, huyền phù tế bào, mô phôi soma, mô sẹo có khả năng sinh phôi.. - nuôi tế bào trong môi trường lỏng. - tạo và nuôi cấy rễ bất định ở một số quy mô và phương thức nuôi cấy khác nhau nhưng chưa ghi nhận được công bố kết quả nghiên cứu nuôi nhân mô sẹo có khả năng sinh phôi (có ít nhiều sắc tố xanh lục) trong môi trường lỏng, nuôi mô phôi soma trong môi trường thạch và lỏng theo hai hướng phát sinh hình thái chồi và rễ kể cả nuôi nhân sinh khối loại mô quan trọng này.. - Lá được cắt thành các mảnh kích thước 5 × 5 mm và cấy vào môi trường tạo mô sẹo.. - Môi trường và điều kiện nuôi cấy Môi trường. - Tạo và nuôi nhân mô sẹo. - Tạo mô sẹo từ mảnh lá: môi trường MS [19]. - Tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi (KNSP):. - Nuôi nhân mô sẹo có KNSP trong môi trường lỏng: môi trường MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l NAA (30 g/l đường saccharose).. - Tạo huyền phù mô tế bào theo hướng không tạo phôi soma từ mô sẹo có KNSP: MS + 2 mg/l 2,4-D (30 g/l đường saccharose).. - Tạo huyền phù mô tế bào theo hướng tạo phôi soma từ mô sẹo có KNSP: môi trường B5 [11. - Tạo mô phôi từ mô sẹo/mô sẹo có KNSP:. - Tạo phôi/cụm phôi có lá mầm phát triển trên môi trường thạch: môi trường White [32] (50 g/l đường saccharose).. - Nuôi mô phôi trong môi trường lỏng theo hướng tạo chồi: MS½ + 2 mg/l NAA + 0,1 mg/l BA (20 g/l đường saccharose).. - Nuôi mô phôi trong môi trường lỏng theo hướng tạo rễ: MS½ + 2 mg/l NAA (20 g/l đường saccharose).. - Nuôi nhân rễ có nguồn gốc từ mô phôi qua nuôi cấy trong môi trường lỏng: B5 + 3 mg/l NAA (50 g/l đường saccharose).. - Tạo và nuôi rễ từ cụm phôi trên môi trường thạch: B5 + 5 mg/l IBA (50 g/l đường saccharose).. - Nuôi nhân mô phôi trong môi trường lỏng:. - Môi trường có pH 5,8. - Điều kiện nuôi cấy. - Để tối ở nhiệt độ 25-28 C đối với nuôi cấy mô sẹo chưa sinh phôi, huyền phù tế bào và nuôi cấy tạo rễ. - điều kiện sáng và nhiệt độ như trên đối với nuôi cấy mô sẹo sinh phôi, chồi, cây. - Quan sát cụm tế bào, phôi soma nuôi cấy trong môi trường lỏng/thạch bằng kính hiển vi soi ngược Olympus (Nhật Bản), kính hiển vi soi nổi Leica (Đức) ở vật kính 10X và 20X.. - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo và nuôi nhân mô sẹo. - Sau khử trùng, lá chét (hình 1a) được cắt thành các mảnh (hình 1b) và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo MS có 2 mg/l 2,4-D. - Sau khoảng 1 tháng nuôi, nhận thấy mô sẹo hình thành ở mép cắt (vị trí gần cuống lá), có cụm mô hình thành trên bề mặt phiến lá (hình 1c). - cấy mô [23, 24] để tạo nguồn vật liệu mô sẹo.. - Mô sẹo sau đó được cắt thành các mảnh nhỏ và cấy chuyển sang môi trường mới để tiếp tục nghiên cứu.. - Khi được nuôi cấy trên môi trường MS có nồng độ 2,4-D giảm (1 mg/l 2,4-D) và có bổ sung 1 mg/l NAA, 0,2 mg/l kinetin,10% nước dừa và để mô ở điều kiện sáng, mô sẹo lá chuyển sang trạng thái cứng (compact) hơn, có sự hình thành diệp lục tố do để ở điều kiện sáng, có khả năng sinh phôi (hình 1e) và sau đó có khả năng bước vào giai đoạn hình thành phôi soma dạng cầu (global) (hình 1f). - Nếu tiếp tục cấy chuyền mô sẹo sang môi trường chỉ có 2,4- D (2 mg/l) trong thời gian dài nhận thấy kết cấu mô sẹo xốp dần, ghi nhận có trường hợp màu hơi vàng (hình 1g) và đôi khi có sự hình thành cụm mô với kết cấu tơi xốp, trắng (hình 1h).. - Sự hình thành mô sẹo từ lá và các loại mô sẹo lá qua nuôi cấy.. - Mảnh lá dùng nuôi cấy. - Sự hình thành mô sẹo lá sau khoảng 1 tháng và 2 tháng nuôi cấy. - Mô sẹo có khả năng sinh phôi sau 1,5 tháng nuôi cấy mô sẹo có nguồn gốc mảnh lá. - Mô sẹo ở giai đoạn ban đầu hình thành phôi soma. - Cụm mô sẹo xốp. - Cụm mô sẹo rất xốp.. - Các cụm mô sẹo có KNSP được dùng nuôi cấy trong môi trường lỏng MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l NAA để nhân sinh khối. - Kết quả bước đầu cho thấy mô tăng sinh khối tươi, gấp khoảng 3 lần sau 2 tháng nuôi cấy lắc trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường. - (cấy 2 g mô sẹo/bình) và hiện mô đang được nhân sinh khối trong bình tam giác 500 ml chứa 200 ml môi trường.. - Vật liệu sử dụng để nuôi cấy tạo huyền phù tế bào là mô sẹo có KNSP, kích thước các cụm mô nuôi cấy khoảng 0,5 cm, khối lượng mô nuôi cấy khoảng 3 g/50 ml môi trường trong bình tam giác 250 ml. - Sự hình thành huyền phù mô tế bào tăng sinh không theo hướng tạo phôi hoặc theo hướng tạo phôi tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy. - Trong nghiên cứu này, mô sẹo có KNSP được sử dụng có kết cấu không quá. - Khi nuôi mô sẹo có KNSP dùng môi trường MS bổ sung 2 mg/l 2,4-D. - Trong quá trình thay môi trường mới cho mô (15 ngày/lần), các cụm mô có kích thước to, chuyển sang nâu được loại bỏ và sau khoảng 3-4 tháng nuôi quần thể mô nhận được bao gồm các cụm tế bào có kích thước trung bình (2-3 mm) và nhỏ. - Sự tăng sinh của tế bào nuôi cấy trong môi trường lỏng theo hướng không tạo phôi soma (quan sát dưới kính hiển vi soi ngược).. - Ngược lại, khi dùng môi trường B5 bổ sung 3 mg/l NAA, nhận thấy có hiện tượng hình thành phôi cầu trên bề mặt cụm mô sẹo (hình 3a, b). - sau đó các phôi này rơi vào môi trường (hình 3c, d). - tháng, nhận thấy có khá nhiều phôi tròn treo trong môi trường. - phát triển thành cây con hoàn chỉnh khi được cấy chuyển sang môi trường lần lượt là MS½ + 0,5 mg/l BA + 1 mg/l GA 3 và MS½ + 0,5 mg/l BA (hình 3f, g, h).. - Sự hình thành huyền phù phôi soma từ nuôi cấy mô sẹo có khả năng sinh phôi trong môi trường lỏng. - Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi sau 1 tháng nuôi cấy trong môi trường lỏng. - Để tạo mô phôi soma, mô sẹo/mô sẹo có khả năng sinh phôi được nuôi cấy trên môi trường MS½ + 0,2 mg/l 2,4-D + 10% nước dừa.. - Thời gian hình thành phôi soma nhanh hay chậm, từ 2 đến 3 tháng tùy thuộc loại mô sẹo sử dụng. - Khi được cấy chuyển sang môi trường White, các phôi cầu dần hình thành lá. - Nuôi nhân mô phôi soma trong môi trường lỏng MS½ + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l BA đã được thực hiện nhằm tạo tiền đề cho nghiên cứu nuôi nhân sinh khối quy mô lớn để thu hoạt chất. - Mô phôi tăng sinh, theo chúng tôi, trên cơ sở trong môi trường nuôi cấy nêu trên có sự hình thành các cụm mô phôi tròn nhỏ (“nốt phôi”) trên khắp bề mặt phôi cầu đơn và phôi cầu đôi (hình 5a, b), trên khắp phần thân và thậm chí trên rễ của phôi đơn và phôi đôi mang rễ (hình 5c, d). - sinh phôi soma qua nuôi cấy mô trong môi trường lỏng ở loài Panax ginseng (Araliaceae). - Quá trình phát triển phôi soma tạo từ mô sẹo lá. - Quần thể phôi cầu hình thành từ mô sẹo lá. - Sự hình thành các “nốt phôi” mới từ phôi soma nuôi trong môi trường lỏng. - Cận cảnh các “nốt phôi” mới hình thành trên bề mặt phôi cầu đơn và phôi cầu đôi nuôi trong môi trường lỏng. - Sự tăng sinh mô phôi nuôi cấy trong môi trường thạch và lỏng, theo chúng tôi, là do hiện tượng sinh phôi thứ cấp nói chung (secondary somatic embryogenesis) bao gồm phôi thứ cấp cấp 1 (secondary), cấp 2 (tertiary) từ phôi sơ cấp (primary embryo) liên tục xảy ra trong quá trình nuôi dẫn đến sự hình thành cụm đa phôi (poly/multi-embryos). - Quá trình hình thành phôi soma thứ cấp qua nuôi cấy. - Theo hướng tạo chồi, mô phôi ở dạng đơn hoặc cụm đa phôi (2-3 phôi) (khoảng 200 mg) được nuôi cấy trong môi trường MS½ bổ sung 2. - các cụm đa phôi có khuynh hướng tăng sinh tạo phôi cầu treo vào môi trường và từ đó các phôi cầu này bắt đầu quá trình tạo rễ. - Nuôi mô phôi dạng cầu trong môi trường lỏng theo hướng tạo phôi soma hoàn chỉnh và cây con. - Mô phôi cầu sau 15 ngày nuôi cấy. - Quần thể phôi với cực rễ phát triển sau 2 tháng nuôi cấy. - Cận cảnh phôi đơn hình thành trong môi trường lỏng với cực rễ phát triển và cực chồi phát triển chưa hoàn chỉnh. - Cận cảnh phôi đơn phát triển cực chồi qua nuôi cấy trên môi trường thạch. - Quá trình phôi phát triển tạo lá thật thành cây con trên môi trường thạch.. - Theo hướng tạo rễ, tương tự trường hợp tạo chồi nêu trên, mô phôi được nuôi cấy trong môi trường lỏng MS½ + 2 mg/l NAA. - theo chúng tôi, do môi trường chỉ có NAA và không chứa BA như ở trường hợp nuôi tạo chồi. - Các “búi rễ” dạng cầu này tăng sinh khá nhanh do điều kiện môi trường tốt hơn khi được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường B5 + 3 mg/l NAA (50 g/l đường) (hình 8e). - Nuôi mô phôi dạng cầu trong môi trường lỏng theo hướng tạo và nhân rễ. - Mô phôi bước đầu tạo rễ trong môi trường lỏng sau 30 ngày nuôi. - Cận cảnh phôi đơn với cực rễ hình thành trong môi trường lỏng. - Rễ sau 3 tháng nuôi cấy với sự hình thành “búi rễ”. - “Búi rễ” tăng sinh khối sau 2 tháng nuôi cấy riêng.. - Cụm phôi tạo rễ trên môi trường B5 bổ sung 5 mg/l IBA. - Cận cảnh phôi đơn (từ cụm phôi) tạo rễ với các mức độ khác nhau trên môi trường. - Cụm phôi tiếp tục tạo rễ trên môi trường B5 bổ sung 5 mg/l IBA sau 3 tháng nuôi. - Rễ (không có mô phôi mẹ) tiếp tục phát triển trên môi trường B5 như trên, sau 3 tháng nuôi.. - Ngoài thí nghiệm tìm hiểu khả năng tạo rễ của mô phôi cầu trong môi trường lỏng, cụm phôi (kích thước khoảng 0,5 cm) mang lá mầm hình thành trên môi trường White (hình 4f) cũng đã được sử dụng nuôi cấy trên môi trường thạch nhằm tìm hiểu khả năng tạo rễ. - Việc áp dụng môi trường B5 có bổ sung 5 mg/l IBA đã kích thích tạo rễ rất tốt đối với cụm phôi (hình 9a), kết quả này phù hợp với kết quả môi trường khoáng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nêu trên tạo rễ tốt nhất đối với đoạn cắt rễ bất định của Nguyễn Thị Liễu và nnk. - Nhận thấy phôi trên môi trường có IBA nồng độ nói trên, phôi đơn cấu thành cụm phôi tạo nhiều rễ bất định và rễ nhánh khác ngoài rễ cọc/trụ điển hình (hình 9b, c). - Rễ có mô mẹ hoặc không có mô mẹ khi được nuôi nhân tiếp tục dùng môi trường có nồng độ IBA nói trên đã tiếp tục tăng sinh khối tạo “đệm rễ” trên bề mặt môi trường (hình 9e, f).. - Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et.. - Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Hà et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro. - Nuôi cấy rễ bất định của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. - Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối và sự tích lũy sản phẩm ginsenoside trong nuôi cấy tế bào lỏng của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt