- ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN - 455G/A TRÊN GEN FIBRINOGEN BETA. - Ở BỆNH NHÂN NHỒI MÁU CƠ TIM TRẺ TUỔI. - Lương Thị Lan Anh, Trương Thị Thanh Hương Trường Đại học Y Hà Nội Ngày nay, các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ tuổi có tính gia đình, không rõ các nguy cơ môi trường gây bệnh, có thể liên quan đến đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta (FGB) quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen. - Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, có so sánh với giải trình tự gen để phát hiện đột biến -455G/A ở 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp <. - 60 tuổi được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch Việt Nam. - Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta là 25%. - Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% và 16,67%, các kết quả phù hợp với giải trình tự gen. - Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến - 455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp trẻ tuổi.. - Từ khoá: Nhồi máu cơ tim cấp, gen FGB, đột biến - 455G/A. - Nhồi máu cơ tim được xếp thứ nhất trong số 7 nhóm bệnh gây tử vong hàng đầu trên thế giới. - Ước tính ở Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu bệnh nhân nhập viện mỗi năm vì nhồi máu cơ tim cấp và khoảng 200.000 đến 300.000 bệnh nhân tử vong hàng năm vì nhồi máu cơ tim cấp [1]. - Tại Việt Nam, nhồi máu cơ tim cấp đang có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây, tỷ lệ tử vong vẫn còn cao và đang là vấn đề thời sự rất được quan tâm. - Năm 2003, theo thống kê của Viện Tim mạch Quốc gia Việt Nam, tỷ lệ bệnh nhân vào viện vì nhồi máu cơ tim cấp là 4,2%, đến năm 2007 con số này là 9,1%. - Theo các nghiên cứu, đa phần người cao tuổi mắc phải căn bệnh này, tuy nhiên nhiều trường hợp nhồi máu cơ tim xuất hiện ở người <. - Các nghiên cứu gần đây trên thế giới đề cập đến mối liên quan giữa nhồi máu cơ tim với biến đổi vật chất di truyền ở cấp phân tử. - Các nghiên cứu cho rằng các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ tuổi hoặc có tính gia đình, không rõ các nguy cơ môi trường gây bệnh, có thể liên quan đến đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến - 455G/A của gen Fibrinogen Beta quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen β [4 - 7]. - Đột biến -455G/A trên gen có thể gây tác động mạnh nhất lên tốc độ tổng hợp của toàn phân tử fibrinogen, từ đó làm tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim [8].. - Để phát hiện đột biến điểm -455G/A trên gen Fibrinogen Beta, phương pháp sinh học phân tử thường được nghĩ tới đầu tiên là giải trình tự gen, nhưng không phải cơ sở nghiên. - cứu và ứng dụng nào cũng có thể làm được bởi yêu cầu phải có hệ thống giải trình tự gen và chi phí tiêu hao cho giải trình tự gen khá tốn kém. - Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay, chúng tôi chưa thấy tác giả nào nghiên cứu và ứng dụng kĩ thuật này trong việc phát hiện đột biến -455G/A nhằm góp phần tầm soát sớm bệnh nhồi máu cơ tim.. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm: xác định đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta bằng kỹ thuật Realtime PCR.. - 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp <. - được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai.. - Phương pháp: nghiên cứu mô tả.. - Quy trình nghiên cứu. - Thực hiện kỹ thuật Realtime PCR phát hiện đột biến -455G/A. - Gen Fibrinogen Beta được thiết kế nhân lên bằng kỹ thuật PCR trên vùng promoter tại vị trí nucleotide xác định theo ngân hàng trình tự gen Quốc tế (GenBank, M 64983.1).. - Primer - Probe phát hiện gen FGB. - Mồi – Đoạn dò Trình tự 5. - Phản ứng Realtime PCR được tiến hành 6 phản ứng:. - Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe không đột biến.. - Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe đột biến.. - Chứng đột biến.. - Chứng không đột biến.. - Chứng âm (nước cất) với phản ứng có probe không đột biến.. - Chứng âm (nước cất) với phản ứng có probe đột biến.. - Khuếch đại đoạn gen Fibrinogen Beta (PCR) bằng hệ thống luân nhiệt của máy Realtime PCR (Bio-Rad CFX96).. - So sánh kết quả Real time PCR với giải trình tự gen FGB. - Gen Fibrinogen Beta được nhân lên bằng kỹ thuật PCR (sử dụng cặp mồi FGBf3m - FGBr4m) với 40 chu kì luân nhiệt (95 o C - 5 phút/ 60 o C - 30 giây/72 o C - 30 giây). - Giải trình tự gen Fibrinogen Beta bằng hệ thống ABI se- quencer được thực hiện trên máy Applied Bio- systems 3.100.. - Đối chiếu kết quả phát hiện đột biến - 455G/A của gen Fibrinogen Beta bằng kỹ thuật realtime PCR với kết quả giải trình tự.. - Kết quả phù hợp khi các bệnh nhân có kết quả Realtime PCR và giải trình tự tương ứng với nhau.. - Kết quả nghiên cứu gen Fibrinogen Beta trên máy Realtime PCR được phân tích bằng phần mềm CFX Manager™Software.. - Kết quả giải trình tự gen: các thông số và chất lượng đỉnh được thu thập, kiểm định bằng các phần mềm ABI Data Collection v2.0 và Sequencing Analysis Sotwave v5.3.. - Trình tự đoạn promoter của gen Fibrinogen Beta của mẫu bệnh và chứng người Việt Nam được so sánh với trình tự tham chiếu công bố trên GenBank thông qua sử dụng phần mềm phân tích Chromas Lite v2.1.1 và Seaview để xác định đột biến điểm.. - Đạo đức nghiên cứu. - Đối tượng nghiên cứu được thông báo rõ về mục đích nghiên cứu, được cung cấp thông tin và bệnh nhân đồng ý tự nguyện tham gia nghiên cứu. - Đối tượng nghiên cứu được giữ kín bí mật cá nhân và được phản hồi kết quả nghiên cứu.. - KẾT QUẢ. - Thông tin mẫu nghiên cứu. - Có tổng số 20 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, trong đó có 14 nam và 6 nữ. - Độ tuổi trung bình của các bệnh nhân là từ 18 - 56 tuổi.. - Tuổi trung bình của các bệnh nhân nghiên cứu. - Giới Tuổi trung bình chung của các bệnh nhân. - Tuổi trung bình ở những bệnh nhân nghiên cứu là tuổi. - Tuổi trung bình ở những bệnh nhân nam tuổi) lớn hơn bệnh nhân nữ tuổi).. - Phát hiện đột biến -455G/A bằng kỹ thuật Realtime PCR 2.1. - Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A. - Giới n Số bệnh nhân có đột biến gen Tỷ lệ đột biến/ giới. - Có 5 trên tổng số 20 bệnh nhân phát hiện mang đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, chiếm 25%, trong đó có 4 nam (80%) và 1 nữ (20%).. - Tỷ lệ phát hiện đột biến gen ở nam và nữ có sự khác nhau, tuy nhiên không có ý nghĩa thống kê (p >. - Hình ảnh Realtime PCR phát hiện đột biến -455G/A. - Kết quả Realtime PCR và giải trình tự ở mẫu không có đột biến và mẫu đột biến -455G (không đột biến). - Chứng hoặc mẫu đột biến Chứng âm. - Chứng hoặc mẫu không đột biến Chu kì ngưỡng (Ct). - Kiểu gen đột biến -455G/A. - Trong số 5 bệnh nhân phát hiện có đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, kiểu gen đều là đồng hợp tử, tức cả hai alen của gen đều bị đột biến, không có trường hợp nào kiểu gen là dị hợp tử (chỉ có 1 alen bị đột biến).. - Đối chiếu kết quả Realtime PCR với giải trình tự đột biến -455G/A. - So sánh kết quả phân tích đột biến -455G/A của gen FGB ở 20 bệnh nhân bằng kỹ thuật Real- time PCR và kỹ thuật giải trình tự gen, kết quả như sau:. - Sự phù hợp giữa kết quả Realtime PCR và giải trình tự gen Fibrinogen Beta với đột biến -455G/A Bệnh nhân. - nhồi máu cơ tim. - Phân tích bằng kỹ thuật Realtime PCR (1). - Phân tích bằng kỹ thuật giải trình tự (2). - Đột biến -455G/A 5 5 100%. - Không đột biến 15 15 100%. - Kết quả tìm đột biến của 2 phương pháp Realtime PCR và giải trình tự ở các bệnh nhân là như nhau, tỷ lệ phù hợp là 100%.. - Sau khi hoàn chỉnh thành công kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, nghiên cứu này bước đầu ghi nhận và xử lý các số liệu về đột biến -455G/A ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim trẻ tuổi. - Mặc dù còn hạn chế về cỡ mẫu, tuy nhiên đây cũng là mở đầu cho các nghiên cứu tiếp theo chi tiết hơn về đột biến này.. - Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở các bệnh nhân nhồi máu cơ. - tim trẻ tuổi trong nghiên cứu này là 25%. - Theo một nghiên cứu năm 2004, tỉ lệ người mang đột biến -455G/A trong nhóm bệnh nhân xơ vữa động mạch là 25,8%, cao hơn so với tỉ lệ 15,2% ở nhóm chứng không mắc bệnh [9].. - Nghiên cứu khác cho thấy, tỉ lệ đột biến - 455G/A ở 885 nam giới tuổi dưới 70, có tiền sử cơn đau thắt ngực là 21%, còn một nghiên cứu năm 2014, tỉ lệ đột biến này là 35,3% tính trên 486 bệnh nhân có tiền sử đột quỵ [10;. - Như vậy có thể thấy, tỉ lệ phát hiện đột. - biến trong nghiên cứu của chúng tôi khá tương đồng so với các tác giả khác trên thế giới. - Ngoài ra, một nghiên cứu năm 1999 cho thấy đột biến -455G/A làm tăng 5,4% lượng fibrinogen, kết hợp với 1 đột biến khác cũng trên gen Fibrinogen Beta là -854G/A thì tỉ lệ này tăng lên xấp xỉ 11%, hay nghiên cứu năm 1998 cũng kết luận kiểu gen -455AA có nồng độ fibrinogen trung bình là 3,9 g/L so với trung bình 3,1 g/L của kiểu gen -455GG [10. - Điều này cho thấy đột biến -455G/A đóng vai trò quan trong trong sự gia tăng nồng độ fi- brinogen, chứng tỏ tầm quan trọng của nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến này.. - 75% các trường hợp còn lại không phát hiện có đột biến -455G/A có thể bệnh nhân mắc các đột biến khác ngoài đột biến trên.. - Theo một thống kê, các bệnh nhân nhồi máu cơ tim do đột biến gen Fibrinogen Beta, ngoài đột biến -455G/A hay gặp còn có thể xuất hiện các đột biến -148C/T, -249C/T, -854G/A. - Điều này sẽ giúp mở ra những hướng mới cho các nghiên cứu sau này.. - Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% ở nam và 16,67% ở nữ, tuy nhiên không có ý nghĩa thống kê, (p >. - 100% các trường hợp đột biến đều có kiểu gen đồng hợp tử, điều này cũng phù hợp với đặc điểm di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường của gen, khi ở trạng thái đồng hợp tử mới biểu hiện bệnh.. - Đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp trẻ tuổi, các kết quả phân tích phù hợp với kết quả giải trình tự gen.. - Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57%. - Nghiên cứu thực hiện thành công nhờ sự hỗ trợ của Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Tim mạch Việt Nam và Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á.. - Nghiên cứu giá trị NT-PRO-BNP trong nhồi máu cơ tim cấp không ST chênh lên. - APPLICATIONS OF REALTIME PCR TO DETECT -455G/A IN FIBRINOGEN BETA (FGB) GENE IN YOUNG PATIENTS. - Myocardial infarction in younger individuals or familial myocardial infarction of unknown etiol- ogy may be related to genetic mutations, including mutations common -455G/A Fibrinogen Beta gene regulations fibrinogen chain synthesis. - Mutations -455G/A of Fibrinogen Beta gene identified by using Real - time PCR is compared with sequencing results. - The mutation detection rates of -455G/A in the Fibrinogen Beta gene was 25%.. - Researchers have successfully applied Real-time PCR techniques to detect mutations 455G/A in the Fibrinogen Beta gene in younger patients with acute myocardial infarction.
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt