- THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ CẤU HÌNH CỦA ASARONE. - α-asarone, β-asarone, GC-MS, NMR, cột sắc ký mở. - “Thuy xuong bo” (Acorus sp.) were determined by GC-MS and MNR analyses. - The content ratios of other components, excepting for 1H-Cyclopropa[α]naphthalene (13.4%) and (-)-Aristolene (5.8. - Thành phần hóa học và cấu hình của asarone trong dịch trích thân rễ cây thủy xương bồ (Acorus sp.) đã được xác định bằng các kỹ thuật phân tích GC-MS và NMR. - Kết quả phân tích cho thấy dịch trích thân rễ cây TXB chứa ít nhất 9 hợp chất. - Trong đó, β-asarone là thành phần hóa học chính với tỷ lệ hiện diện chiếm 66,8%. - Các hợp chất còn lại, trừ 1H-Cyclopropa[α]naphthalene (13,4%) và (-)-Aristolene (5,8. - Mặt khác, cột sắc ký mở sử dụng hỗn hợp 20% nitrat bạc trong silica gel làm pha tĩnh và pha động là hỗn hợp tăng lũy tiến của 2% benzen trong n-hexane là có khả năng tinh lọc β-asarone trong mẫu ly trích.. - Các kết quả phân tích cho thấy thành phần chính của tinh dầu ly trích từ sự chưng cất cây A.. - calamus là hợp chất β-asarone (Koul et al., 1990), trong khi hỗn hợp của α-asarone và β-asarone (Hình 1) là thành phần chủ yếu trong tinh dầu ly. - trích từ thân rễ cây A. - gramineus (Lee et al., 2002). - Bột nghiền và tinh dầu ly trích từ thân rễ (rhizome) cây A. - phaseoli (Coleoptera: Bruchidae) (Shukla et al., 2009;. - Rahman and Schmidt, 1999) và loài ve (tick) Rhipicephalus (Boophilus) microplus gây hại gia súc (Ghosh et al., 2010). - Hiệu lực gây chết của dịch trích thân rễ A. - gramineus đã được đánh giá trên rầy nâu (Nilaparvata lugens) và sâu tơ (Plutella xylostella) (Lee et al., 2002). - Theo kết quả đánh giá của Koul et al. - Ngoài ra, hiệu lực ức chế sự phát triển đối với một số loài vi khuẩn và tảo của asarone cũng đã được ghi nhận (McGraw et al., 2002. - Pollio et al., 1993).. - α-Asarone β-Asarone Hình 1: Công thức cấu tạo của asarone. - Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xác định thành phần hóa học, phân lập và xác định cấu hình của asarone trong dịch trích thân rễ cây TXB từ đó làm tiền đề cho việc nghiên cứu và ứng dụng loại vật liệu này trong phòng trị côn trùng và bệnh hại cây trồng ở ĐBSCL.. - 2.2 Thân rễ cây thủy xương bồ và mẫu ly trích Cây TXB con được thu thập từ các vườn thuốc gia đình quanh khu vực Thành phố Cần Thơ rồi chuyển về Bộ môn BVTV để trồng trong các chậu sứ đặt trong nhà lưới cho đến khi cây nảy chồi (khoảng 20 ngày). - Phần thân rễ của cây mẹ sẽ được tách lấy, loại bỏ lớp vỏ khô bên ngoài, rửa sạch bằng nước máy, phơi nắng một giờ, cắt thành. - Phần dịch lỏng của hỗn hợp sẽ được gạn vào một phễu phân tách. - Lượng ethyl acetate rửa được gạn vào kết hợp với phần dịch lỏng trong phễu ly trích. - 2.3 Xác định thành phần hóa học trong mẫu ly trích. - Thành phần hóa học trong mẫu ly trích được xác định bằng phân tích Sắc ký khí - Khối phổ (Gas Chromatography - Mass Spectrometry, GC- MS). - Máy liên hợp GC-MS gồm GC HP 6890 series và đầu dò MS (Mass Selective Detector) HP 5973. - Cột sắc ký dùng trong phân tích là cột mao dẫn DB-23 (capillary column, 0,25 mm ID x 30 m. - Danh pháp và công thức hóa học của các thành hóa học trong dịch ly trích được xác định bằng cách so sánh kết quả phân tích với cơ sở dữ liệu khối phổ của Agilent (Agilent Technology, Mỹ).. - Đối với thành phần asarone, sự so sánh còn được tiến hành với chất chuẩn α-asarone (Aldrich, Mỹ).. - 2.4 Xác định cấu hình của asarone trong mẫu ly trích. - Asarone trong mẫu ly trích thân rễ cây TXB sẽ được phân lập bằng kỹ thuật ly trích phân đoạn sử dụng cột sắc ký mở với silica gel làm pha tĩnh.. - Sự xuất hiện của asarone trong mỗi phân đoạn được kiểm tra bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) lấy chỉ số Rf của α-asarone làm điểm chuẩn. - Các phân đoạn chứa asarone được phân tách tiếp bằng kỹ thuật tương tự, nhưng pha tĩnh của cột sắc ký được thay bằng hỗn hợp 15% nitrate bạc (AgNO 3 ) trong silica gel và pha động là 200 ml các hỗn hợp dung môi của 2% tăng lũy tiến bezen trong n-hexane. - Thành phần asarone trong mỗi phân đoạn được kiểm tra bằng phân tích GC-MS. - Các phân đoạn chứa một thành phần asarone sẽ được kết hợp, cô đặc và phân tích bằng kỹ thuật Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance, NMR).. - Dung môi sử dụng cho phân tích là deuterium chloroform (CDCl 3 ) với Tetramethylsilane (TMS) được dùng làm chất nội chuẩn (internal standard). - Nhiệt độ của mẫu khi phân tích là 20 0 C.. - 3 KẾT QUẢ. - 3.1 Thành phần hóa học trong mẫu ly trích của thân rễ cây TXB. - Kết quả phân tích GC-MS của mẫu ly trích thân rễ cây TXB cho thấy trong thành phần của mẫu bao gồm ít nhất 9 hợp chất. - Trong đó β-asarone chiếm tỉ lệ cao nhất với 66,8%, kế đến là hợp chất 1H-Cyclopropa[α]naphthalene với tỉ lệ 13,4% và (-)-Aristolene với tỉ lệ 5,8%, các hợp chất còn lại, kể cả α-asarone, đều không vượt quá tỷ lệ 3% (Bảng 1). - Điều này chứng tỏ β-asarone là thành phần hóa học chủ yếu của dịch trích thân rễ cây TXB.. - Bảng 1: Thành phần hóa học trong dịch trích thô của thân rễ cây thủy xương bồ được xác định bằng GC-MS a. - phân tử. - Phân tử lượng. - Ion peaks (m/z) Base Phân tử. - a Cột phân tích: DB-23. - b Theo danh pháp của Liên đoàn Hóa học Tinh khiết và Ứng dụng Quốc tế (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC): hợp chất 1 là 1,1,7,7a-Tetramethyl-1a,3a,4,5,6,7,7a,7b-octahydro-1H-cyclopropa[α]naphthalene. - hợp chất 2 là 1,1,7,7a-Tetramethyl-1a a,7b-octahydro-1H-cyclopropa[α]naphthalene. - hợp chất 3 là 2-Isopropenyl-4-. - hợp chất 4 là 1,2-Dimethoxy-4-propenyl-bezen. - hợp chất 5 là 1,1,7-Trimethyl-4- methylene-decahydro-cyclopropa[e]azulen-7-ol. - hợp chất 6 là 5-Allyl-1,2,3-trimethoxy-benzen. - hợp chất 7 là 1,2,4-Trimethoxy- 5-propenyl-benzen(Z). - hợp chất 8 là 1,2,4-Trimethoxy-5-propenyl-benzen(E). - hợp chất 9 là 4-Isopropylidene-3,8-dimethyl a-hexahyro-1H-azulen-5-one. - 3.2 Cấu trúc hóa học của asarone trong mẫu ly trích. - 3.2.1 Phân tích GC-MS. - Kết quả trình bày trong Hình 2 cho thấy trên biểu đồ Sắc ký tổng ion (Total ion chromatogram, TIC) hai hợp chất asarone (hợp chất 7 và 8 trình bày ở Bảng 1) xuất hiện ở các thời gian lưu. - Phổ khối lượng (Mass spectrum) của hợp chất 7 và 8, và Rt của hợp chất 8 là trùng khớp với chất chuẩn α-asarone, chứng tỏ hợp chất 7 là β-asarone và hợp chất 8 là α-asarone. - Như vậy, trong phân tích GC-MS, phổ khối lượng của α-asarone và β-asarone là tương tự nhau, đặc điểm phân biệt rõ rệt nhất giữa hai hợp chất này là thời. - gian lưu của chúng xuất hiện trên biểu đồ sắc ký tổng ion. - Kết quả phân tích cho thấy cột sắc ký mao dẫn phân cực DB-23 và chương trình nhiệt độ bắt đầu ở 50 0 C ổn định trong 2 phút, tăng lên. - 160 0 C ở tốc độ 4 0 C/phút, tiếp tục tăng lên 220 0 C ở tốc độ 10 0 C/phút, ổn định ở 220 0 C trong 15 phút là thích hợp cho việc phân tích các hợp chất α-asarone và β-asarone.. - Hình 2: Phân tích GC-MS của mẫu ly trích từ thân rễ cây TXB (bên trên) và mẫu chuẩn α-asarone (bên dưới) 1. - 3.2.2 Phân tích NMR. - Bên cạnh việc phân tích bằng GC-MS, cấu. - hình của asarone trong mẫu ly trích cũng đã được xác định bằng phân tích phân tích NMR.. - Hình 3: Chemical shift và hằng số bắt cặp của các proton ở vị trí C 3 , C 6 , C 7 và C 8 trong phân tử α-asarone (bên trên) và asarone phân lập (bên dưới). - Phổ 1 H NMR của mẫu α-asarone (mẫu chuẩn) và mẫu asarone phân lập được trình bày trong Hình 3 cho thấy độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) của các proton (H) ở vị trí carbon thứ 3 (C 3 ) (s, 6,54 ppm), C 6 (s, 6,84 ppm), C 7 (dd ppm) và C 8 (dq ppm) trong phân tử asarone của mẫu phân lập là rất khác biệt so với proton ở các vị trí C 3 (s, 6,50 ppm), C 6 (s, 6,95 ppm), C 7 (dd ppm) và C 8 (dq ppm) trong phân tử α-asarone. - trong phân tử của mẫu phân lập có cấu hình Z (cis). - Hay nói cách khác, asarone trong mẫu phân lập là β-asarone.. - Bảng 2: Độ dịch chuyển hóa học của carbon đồng vị 13 ( 13 C) trong phân tử α-asarone và asarone phân lập. - 13 C ở vị trí* Độ dịch chuyển hóa học (ppm) α-Asarone Asarone phân lập. - Vị trí carbon trong phân tử được biểu thị như trình bày trong Hình 3. - Bảng 2 trình bày kết quả phân tích 13 C NMR của α-asarone và mẫu asarone phân lập. - Độ dịch chuyển hóa học ở vị C 9 của α-asarone là 18,83 ppm còn ở mẫu asarone phân lập là. - Trong khi đó, độ dịch chuyển hóa học ở các vị trí carbon còn lại trong phân tử của hai mẫu phân tích là gần như tương đương nhau. - Sự dịch chuyển hóa học thấp (tương ứng với mức che chắn cao, more shielded) của carbon ở vị trí đầu mạch liền kề với nối đôi (C 9 ) trong phân tử asarone phân lập so với α-asarone chứng tỏ một lần nữa nối đôi giữa vị trí C 7 và C 8 của mẫu asarone phân lập có cấu hình Z (Silverstein and Webster, 1998).. - Kết quả phân tích GC-MS và NMR cho thấy thành phần hóa học của dịch trích thân rễ cây TXB gồm ít nhất 9 hợp chất. - Trong đó, β-asarone là hợp chất chủ yếu chiếm trên hàm lượng asarone) còn α-asarone hiện diện ở một tỷ lệ rất thấp chiếm trên hàm lượng asarone). - Theo Koul et al. - (1990), thành phần chính trong tinh dầu thu được từ sự chưng cất thân rễ cây A. - calamus) là hợp chất β-asarone, trong khi hỗn hợp của α-asarone và β-asarone là thành phần chủ yếu trong tinh dầu A. - Hàm lượng β-asarone trong tinh dầu A. - calamus diploid thì hàm lượng của β-asarone chỉ hiện diện ở mức độ rất thấp (Liddle and Bossard, 1985). - Như vậy, kết quả phân tích đã cho thấy cây TXB được trồng phổ biến ở ĐBSCL là A. - Thân rễ và tinh dầu A. - Comsumer Protection Directorate- General), β-asarone đã cho thấy có tác động gây ung thư yếu đối với chuột ở nồng độ thử nghiệm 20 mg/kg thể trọng/ngày, từ đó chỉ định giới hạn hàm lượng của β-asarone trong thực phẩm. - Kết quả khảo nghiệm trên hệ thống tế bào HepG2 của chuột bởi Unger and Melzig (2012) chứng tỏ α-asarone có tính độc đối với tế bào (cytotoxicity). - cao hơn so với β-asarone, ở điều kiện thông thường cả hai hợp chất này đều không độc đối với vật liệu di truyền của tế bào (genotoxicity), nhưng khi có sự hiện diện của chất kích hoạt biến dưỡng (metabolic activation) thì β-asarone ở nồng độ từ. - Ở khía cạnh khác, các kết quả nghiên cứu của Liu et al. - (2010) và Zou et al. - Trong đánh giá về tính an toàn của thực vật và chế phẩm thực vật dùng trong thực phẩm và chất phụ gia thực phẩm của EFSA (European Food Safety Authority) (2012) thì lá và thân rễ của cây A. - Như vậy, việc nghiên cứu và áp dụng các nguồn vật liệu có nguồn gốc tự nhiên, ít độc và thân thiện với môi trường sinh thái như cây TXB để luân phiên hoặc thay thế cho nông dược hóa học tổng hợp trong bảo vệ thực vật là phù hợp với chủ trương phát triển một nền nông nghiệp bền vững của nhà nước và đáp ứng với yêu cầu thực tế của sản xuất nông nghiệp.. - Tetsu Ando Phòng thí nghiệm Sinh thái học Hóa chất, Trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo (Nhật) đã hỗ trợ trong phân tích GC-MS và NMR.