- PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VIRUS GÂY BỆNH VIÊM GAN VỊT TYPE I Ở TỈNH HẬU GIANG. - Virus, viêm gan vịt, Hậu Giang. - Nghiên cứu phân lập và định danh virus gây viên gan vịt được thực hiện trên 25 mẫu gan vịt thu thập từ những đàn nghi ngờ mắc bệnh viêm gan do virus ở tỉnh Hậu Giang. - Các mẫu bệnh phẩm được phân lập qua phôi vịt, sau đó gây nhiễm cho môi trường tế bào xơ phôi vịt. - Kết quả cho thấy tất cả các mẫu bệnh phẩm đều gây chết phôi vịt với thời gian chết phôi từ 48- 72 giờ. - Bệnh tích điển hình trên phôi là phôi xuất huyết, chậm phát triển;. - Trên môi trường tế bào, biến đổi bệnh lý thể hiện các tế bào co tròn và bị phá hủy tạo thành những vệt tan. - Kết quả giám định virus từ các mẫu đã phân lập bằng kỹ thuật RT-PCR cho thấy trong 25 mẫu bệnh phẩm đều có chứa virus gây bệnh viêm gan vịt A thuộc genotype 3 (DHAV-3).. - Viêm gan vịt do virus (Duck Hepatitis Virus:. - DHV) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây bệnh phổ biến ở vịt con từ 01 đến 28 ngày tuổi, tỷ lệ chết cao, với bệnh tích đặc trưng là gan nhạt màu, xuất huyết. - Bệnh viêm gan vịt gây ra bởi ba loại virus khác nhau gọi là virus viêm gan vịt type 1, type 2 và. - Phổ biến nhất là virus viêm gan vịt type 1 (Kim et al., 2006. - Theo Tseng and Tsai (2007) thì virus viêm gan vịt type 1 được xếp vào chi mới Avihepatovirus thuộc họ Picornaviridae. - Chi này gồm ba loàivirus viêm gan A ở vịt(Duck hepatitis A virus: DHAV) là DHAV- 1, DHAV-2 và DHAV-3. - Virus viêm gan A vịt type 1 (DHAV-1) là virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1: viêm gan vịt do virus type 1 gốc ban đầu) và 2 kiểu gen bổ sung là DHAV-2 (Tseng and Tsai., 2007) và DHAV-3 (Kim et al., 2007a).. - (1985) đã ghi nhận có bệnh viêm gan vịt do virus, nhưng vào thời điểm này chưa phân lập được mầm bệnh.. - Những năm gần đây, cũng có nhiều nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt ở nước ta, nhưng ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long chưa có nghiên cứu nào được thực hiện. - Cho nên việc phân lập và định danh virus viêm gan vịt tại địa phương là hết sức cần thiết, nhằm xác định chính xác virus gây bệnh và tìm ra giải pháp phòng và trị bệnh đạt hiệu quả cao.. - Thu mẫu từ những đàn vịt con từ 01-28 ngày tuổi có biểu hiện triệu chứng như tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết cao, khi chết có tư thế đặc trưng là đầu ngửa lên lưng, hai chân duỗi thẳng, tiến hành mổ khám phát hiện gan sưng xuất huyết hay hoại tử, thận sưng thì tiến hành thu mẫu. - Tổng cộng thu được 25 mẫu gan từ 8 đàn vịt nghi nhiễm bệnh viêm gan vịt do virus ở một số huyện như: Phụng Hiệp, Long Mỹ,. - Phôi vịt 11-14 ngày tuổi dùng để nuôi cấy tế bào, phân lập virus qua môi trường tế bào và phôi trứng.. - Bộ kit tách chiết RNA và sử dụng trong phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction).. - Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR:. - nghiên cứu này sử dụng 3 cặp mồi để xác định virus viêm gan vịt type 1 (DHAV):. - Cặp mồi 1: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-1F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-1R dùng để xác định virus viêm gan A vịt type 1 (theo Chen et al, 2012).. - Cặp mồi 2: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-2F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-2R dùng để xác định virus viêm gan A vịt genotype 2 (theo Chou et al, 2013).. - Cặp mồi 3: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-3F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-3R dùng để xác định virus viêm gan A vịt genotype 3 (theo Chen et al., 2012).. - Bảng 1: Các trình tự mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu. - 2.2.1 Phân lập virus viêm gan vịt qua môi trường phôi trứng vịt. - Tiêm 0,2 ml huyễn dịch bệnh phẩm vào túi niệu mô của phôi vịt 14 ngày tuổi. - Nếu phát hiện phôi chết thì ghi nhận thời gian phôi chết và bệnh tích biểu hiện trên phôi. - Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chết phôi theo thời gian, Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi.. - Tỷ lệ chết phôi theo thời gian. - Tổng số phôi vịt thí nghiệm Số phôi có cùng bệnh tích. - Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi. - Tổng số phôi chết 2.2.2 Phân lập virus viêm gan vịt qua môi. - trường tế bào xơ phôi vịt. - Tạo lớp tế bào xơ phôi vịt sơ cấp. - Qui trình tạo lớp đơn tế bào DEF (Duck Embbyo Fibroblast) được thực hiện theo phương pháp của Doyle and Griffiths (1998).. - Nước trứng, gan phôi sau khi phân lập virus được thu hoạch và gây nhiễm trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp. - 2.3 Định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật RT-PCR. - 2.3.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số RNA tổng số được tách chiết từ dịch virus thu nhận từ môi trường tế bào xơ phôi vịt. - RNA tổng số bao gồm RNA hệ gen của virus viêm gan vịt và RNA của tế bào. - Mục đích tách chiết là để thu nhận hệ gen của virus viêm gan vịt làm khuôn cho phản ứng RT-PCR. - 2.3.2 Thực hiện phản ứng RT-PCR. - Phản ứng RT-PCR được tiến hành qua 2 giai đoạn, bao gồm giai đoạn RT (Reverse Transcription: phản ứng sao chép ngược chuyển mRNA thành cDNA) và giai đoạn PCR (Polymerase Chain Reaction: phản ứng nhân gen).. - trên gel agarose 1,5 % để phát hiện sản phẩm RT- PCR.Sau khi kết thúc điện di, lấy sản phẩm soi trên máy Dolphin-DOC và chụp ảnh lưu giữ mẫu để kiểm tra.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt qua phôi trứng vịt. - 3.1.1 Khảo sát tỷ lệ chết phôi theo thời gian Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào túi niệu mô của trứng vịt có phôi lúc 14 ngày tuổi, sau đó tục ấp ở 37 o C để theo dõi thời gian chết phôi và bệnh tích thể hiện trên phôi. - Kết quả ghi nhận thời gian chết phôi trình bày qua Bảng 2.. - Bảng 2: Thời gian chết phôi sau tiêm truyền (n = 8). - Tỷ lệ chết phôi theo thời gian 48 giờ 72 giờ Tổng số phôi chết. - Tỷ lệ. - 100 Qua Bảng 2 cho thấy, khi tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào phôi trứng thì virus nhân lên và bắt đầu gây chết phôi lúc 48 giờ là 37,5%, lúc 72 giờ chiếm tỷ lệ cao là 62,5%. - tất cả các mẫu huyễn dịch bệnh phẩm khi tiêm vào phôi vịt khi virus nhân lên đều gây chết phôi. - Theo nghiên cứu của Woolcock (1986), virus viêm gan vịt type 1 khi nuôi cấy trên môi trường phôi vịt 10-14 ngày tuổi, virus gây chết phôi trong vòng 24-72 giờ và kết quả nghiên cứu của Jin.X et al. - (2008), khi phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi vịt cho thấy virus gây chết phôi lúc 48-96 giờ sau khi gây nhiễm. - Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy, những mẫu bệnh phẩm chứa nhiều virus thì số lượng virus nhân lên trong phôi nhiều và gây chết phôi nhanh, những mẫu chứa ít virus thì cần phải có đủ thời gian để virus nhân lên với số lượng lớn nên gây chết phôi chậm, qua đó chứng tỏ rằng tất cả các mẫu bệnh phẩm thu thập từ 8 đàn vịt thuộc tỉnh Hậu Giang đều có khả năng chứa virus viêm gan vịt. - Sau khi phát hiện phôi chết, tiến hành mổ khám và ghi nhận bệnh tích biểu hiện trên phôi.. - 3.1.2 Biểu hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm Sau khi kiểm tra phát hiện phôi chết, tiến hành mổ khám xác định bệnh tích trên phôi. - Kết quả biểu hiện bệnh tích trên phôi được ghi nhận ở Bảng 3.. - Bảng 3: Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi (n= 8). - Bệnh tích Tần suất xuất hiện bệnh tích Tổng số Tỷ lệ. - Qua Bảng 3 cho thấy, khi phôi chết có những biểu hiện bệnh tích rất đặc trưng của bệnh viêm gan vịt do virus. - Biểu hiện bên ngoài, phôi xuất huyết, có nhiều trường hợp xuất huyết toàn thân, chiếm tỷ lệ cao 100%. - hiện tượng gan sưng xuất huyết và cơ tim nhạt màu, tỷ lệ 62,5%. - hiện tượng gan sưng có màu vàng cam, tỷ lệ 50%. - gan sưng có màu xanh đen, tỷ lệ 37,5% và gan sưng có màu xanh lá cây, tỷ lệ 14,28%. - ngoài ra còn có biểu hiện phù phôi, tỷ lệ 37,5% và mật căng phồng, tỷ lệ 25%. - Theo nghiên cứu của Levine and Fabricant (1950), khi tiêm virus vào xoang niệu mô phôi vịt 10-14 ngày tuổi sau 24-72 giờ thì phôi chết với bệnh tích đặc trưng như phôi còi cọc, xuất huyết. - Kết quả nghiêm cứu của Jin.X et al. - (2008), phân lập virus qua phôi trứng, khi phôi chết có biểu hiện bệnh lý điển hình trên phôi như phôi còi cọc, xuất huyết da, gan sưng và xuất huyết điểm, phôi chết dịch nước trứng có màu xanh nhạt. - Như vậy, chứng tỏ những mẫu bệnh phẩm đã thu thập có biểu hiện bệnh lý rất đặc trưng của bệnh viêm gan vịt do virus. - Sau khi mổ khám ghi nhận biểu hiện bệnh lý trên phôi, thu hoạch nước trứng và bệnh phẩm là gan của phôi trữ lạnh ở -80 0 C để tiếp tục phân lập trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp.. - Hình 4: Gan màu xanh lá cây Hình 5: Gan màu xanh đen Hình 6: Gan màu vàng cam 3.2 Kết quả phân lập trên môi trường tế. - bào xơ phôi vịt sơ cấp (DEF: Duck Embbyo Fibroblast). - Sau khi nuôi và kiểm tra thấy tế bào đã phủ từ 80-90% bề mặt bình nuôi cấy, tiến hành cho huyễn dịch bệnh phẩm (dịch nước trứng, gan của phôi) đã thu thập từ quá trình phân lập qua phôi trứng vào. - môi trường tế bào. - Virus nhân lên trong tế bào và tạo bệnh tích tế bào có nhiều dạng:. - tế bào co tròn, kết cụm hay tạo thành những vệt tan. - Khi phát hiện có bệnh tích tế bào rõ thì thu hoạch dịch tế bào bảo quản lạnh ở -80 0 C để tiến hành giám định virus bằng kỹ thuật RT-PCR.. - Hình 7a: Tế bào co tròn Hình 7b: Tế bào kết cụm và những vệt tan 3.3 Kết quả định danh virus viêm gan vịt. - bằng kỹ thuật RT-PCR. - Sau khi phân lập trên môi trường phôi trứng vịt và môi trường tế bào. - Chọn 7 mẫu có gây bệnh tích điển hình trên phôi và bệnh tích tế bào để xác định virus gây bệnh.. - Huyễn dịch virus từ môi trường tế bào được tách chiết RNA bằng Bộ kít tách chiết RNA bằng. - Kết quả điện di được thể hiện trên Hình 8.. - Hình 8: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (300bp) trên gel agarose 1,5 % Qua Hình 8 cho thấy, sản phẩm RT-PCR xuất. - Trong 7 mẫu huyễn dịch virus từ môi trường tế bào được chạy qui trình RT- PCR, có 5 mẫu dương tính cặp mồi DHAV-3F, DHAV-3R. - Điều đó chứng tỏ virus viêm gan vịt được phát hiện từ các mẫu bệnh phẩm thu thập từ thực địa ở một số huyện thuộc tỉnh Hậu Giang là virus viêm gan vịt type 1, thuộc subtype 3 (DHAV-3).. - Kết quả phân lập các mẫu bệnh phẩm trên môi trường phôi trứng vịt lúc 14 ngày tuổi, gây chết phôi từ 48 đến 72 giờ, những phôi chết có biểu hiện bệnh tích rất điển hình của bệnh viêm gan vịt do virus. - Khi phân lập trên môi trường tế bào đều thấy virus nhân lên và gây bệnh tích trên tế bào.. - Sau khi điện di sản phẩm RT-PCR cho thấy, virus phát hiện được từ những mẫu bệnh phẩm đã thu thập tại một số huyện thuộc tỉnh Hậu Giang đều là virus viêm gan vịt type 1, thuộc subtype 3 (DHAV-. - Từ kết quả trên chứng tỏ rằng virus viêm gan vịt type 1, thuộc subtype 3 hiện đang lưu hành tại tỉnh Hậu Giang chiếm tỷ lệ rất cao (71,42%).. - Cần phân lập và định danh virus viêm gan vịt ở các địa phương thuộc khu vực Đồng bằng sông Cửu Long để đề ra phương pháp phòng và trị bệnh hiệu quả.. - Improved duplex RT-PCR assay for differential diagnosis of mixed intection of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 in ducklings. - Thăm dò chế tạo vaccine viêm gan vịt và sử dụng. - Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y