- ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ DNA BARCODE TRONG ĐỊNH DANH CÁC MẪU Moina SPP. - Fourty eight Moina sp. - Five groups of Moina sp. - The results revealed that 4/48 Moina sp. - Trong nghiên cứu này, các mẫu Moina sp. - Nghiên cứu đã giải trình tự thành công đoạn gen mtCOI của 48 mẫu Moina sp. - macrocopa và các mẫu Moina spp. - trong đó, 31/48 mẫu Moina sp. - 4/48 mẫu Moina sp. - 8/48 mẫu Moina sp. - thuộc nhóm II, 4/48 mẫu Moina sp. - thuộc nhóm III và 1/48 mẫu Moina sp. - thuộc nhóm IV chứa trình tự gen mtCOI có sự tương đồng thấp hơn 90% so với các loài Moina đã được công bố trên Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (NCBI), Hoa Kỳ nên có thể được ghi nhận là những loài Moina mới, chưa có trình tự mtCOI trên ngân hàng gen.. - Ứng dụng marker phân tử DNA barcode trong định danh các mẫu Moina spp.. - Do đó, trình tự DNA được dùng như “barcodes”. - cho gen này rất mạnh, cho phép khuếch đại đoạn trình tự về phía đuôi 5’ của gen mtCOI. - nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định chính xác và nhanh chóng các loài Moina sp. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân lập, nhân dòng các mẫu Moina spp.. - Với mỗi mẫu nước, 10 cá thể Moina sp. - Sau 7 ngày nuôi, mẫu Moina sp. - 2.2 Định danh hình thái các mẫu Moina sp.. - Tổng cộng 20 cá thể Moina sp. - cố định mẫu với formol 5% và quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học Axio Vision SE64 (Carl Zeiss) dựa theo phương pháp định danh hình thái Moina sp. - 2.3 Giải trình tự DNA. - Mỗi mẫu Moina sp. - 1.6 µM mồi tương ứng được dùng để giải trình tự.. - Mỗi sản phẩm PCR được giải trình tự hai chiều bằng máy Genetic Analyzer 3500 (Hitachi) với BigDye TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Mỹ).. - 2.4 Phân tích kết quả giải trình tự. - Trình tự nucleotide đồng nhất giữa trình tự xuôi và ngược của từng mẫu được xác định bằng công cụ Align Sequence trong phần mềm SnapGene ® 2.3.2 (GSL Biotech. - Các trình tự được so sánh với dữ liệu của ngân hàng gen NCBI bằng công cụ giải thuật so sánh các chuỗi sinh học (Blast) để định danh loài Moina sp. - Các loài có sự tương đồng về trình tự nucleotide ≥ 97% được xác định là. - Sau đó, các trình tự gen mtCOI được hiệu chỉnh về cùng kích thước 561 bp để xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013).. - 3 KẾT QUẢ. - Sau khi bố trí theo phương pháp nêu tại 2.1, kết quả thu được gồm 66 mẫu Moina sp. - Bảng 1: Địa điểm thu thập các mẫu Moina spp.. - 3.2 Định danh Moina spp. - Kết quả định danh hình thái cho thấy có hai loài Moina sp. - Các mẫu Moina sp. - CL1.10. - Hình 4: Mối quan hệ phát sinh loài giữa các mẫu Moina sp. - thu thập trong nghiên cứu này được mô tả bằng cây NJ (Neighbour - joining) dựa trên trình tự 561 bp của gen mtCOI Moina sp.. - Trong tổng số 66 mẫu Moina sp. - sau khi được ly trích DNA chỉ có 48 mẫu Moina sp. - được khuếch đại thành công gen mtCOI bằng cặp mồi LCO1490/HCO2198 để giải trình tự. - Kết quả phân tích mối quan hệ phát sinh loài đưa ra năm nhóm trình tự mtCOI tương đương với năm nhóm Moina sp. - Sự khác nhau giữa các nhóm Moina sp.. - đã phân lập được thể hiện thông qua sự khác nhau giữa các vị trí nucleotide trên vùng trình tự 561 bp của gen mtCOI (Bảng 2).. - Hầu hết các mẫu Moina sp. - trong nhóm I đều có trình tự gen tương đồng với nhau, riêng ba mẫu CP3.3, CP3.5 và CL1.9 có những khác biệt về các nucleotide ở vị trí Hình 5). - Hình 5: So sánh sự tương đồng trình tự gen mtCOI giữa 3 mẫu CL1.9, CP3.3, CP3.5 với các mẫu M.. - micrura khác thuộc nhóm I Các mẫu Moina sp. - Trình tự gen của nhóm II chỉ tương đồng 85% với loài M. - Bốn mẫu Moina sp. - (An Giang) có trình tự gen mtCOI không tương đồng với bốn loài Moina sp. - Trong nhóm này, vị trí nucleotide trên gen mtCOI của 3 mẫu Moina sp. - phân lập ở Châu Phú (An Giang), có khác biệt so với mẫu Moina sp. - Hình 6: So sánh sự tương đồng trình tự gen mtCOI giữa mẫu CL1.5 với 3 mẫu CP1.2, CP1.5, CP2.4 Nhóm IV chỉ có duy nhất mẫu Moina sp. - Kết quả Blast cho thấy trình tự gen mtCOI của mẫu Moina HN2.7 không tương đồng với trình tự mtCOI của bốn loài Moina sp. - thuộc nhóm V gồm: một mẫu ở Mộc Hóa (Long An) và ba mẫu ở Thoại Sơn (An Giang) có trình tự gen mtCOI tương đồng nhau và tương đồng 99% với dòng M. - Bảng 2: Các vị trí sai khác nucleotide trên vùng trình tự mtCOI (561 bp) giữa 48 mẫu Moina sp. - 5 6 0 Trình tự tương đồng T T A T T C A T G T C A G C A C T A A T. - 3.4 So sánh kết quả định danh Moina sp.. - bằng phương pháp hình thái và marker phân tử Trong nghiên cứu này, 48 mẫu Moina sp. - micrura (nhóm I) 8/48 Moina sp. - định 4/48 Moina sp. - (nhóm III) 1/48 Moina sp. - Căn cứ vào trình tự gen mtCOI, 48 mẫu Moina sp. - Theo giả thuyết, các mẫu Moina sp. - có sự khác biệt về trình tự gen mtCOI lớn hơn 3% được xem là khác loài (Hebert et al., 2003). - Do đó, các mẫu Moina sp. - thuộc nhóm II, III có thể là loài Moina khác với bốn loài Moina sp. - Riêng mẫu Moina HN2.7 trong nghiên cứu này và mẫu Moina cf micrura phân lập tại Nga năm 2011 (KX168555.1) có sự tương đồng cao (99%) về trình tự mtCOI nên chúng được xác định là cùng loài. - Tuy nhiên, nhóm tác giả tại Nga chỉ mới so sánh trình tự Moina sp. - micrura và chưa xác định được chính xác tên loài Moina sp. - Trong nghiên cứu này, có 18/66 mẫu Moina sp.. - không được giải trình tự, lý do là chưa khuếch đại được đoạn gen mtCOI với cặp mồi LCO1490/HCO2198 vì không tìm được nhiệt độ bắt cặp phù hợp cho các mẫu Moina sp. - Việc định danh Moina sp. - Điều này được ghi nhận trong nghiên cứu hiện tại, mặc dù kết quả định danh loài Moina sp. - micrura Bỉ (KC479042.1) nên có thể xem nhóm này là loài Moina sp. - Sự phân bố địa lý của các nhóm Moina sp. - Các nhóm Moina sp. - Một số mẫu Moina sp. - Điều này cho thấy tùy theo điều kiện môi trường ao nuôi ở mỗi vùng địa lý, loài Moina sp. - Kết quả nghiên cứu này sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu về đa dạng loài Moina sp. - tại từng địa phương, góp phần chọn ra những dòng Moina sp.. - macrocopa trong cùng một ao nuôi chưa được ghi nhận, nhưng một số mẫu nước ao có sự hiện diện cùng một lúc của ba nhóm Moina sp. - micrura nhóm I (CL1.2, CL1.6, CL1.10) và Moina sp. - nhóm III (CL1.5) và Moina sp. - nhóm II (CL1.1) trong mẫu nước ao CL1 thu ở Cao Lãnh (Đồng Tháp) hoặc Moina sp. - micrura nhóm I (HN 2.4, HN2.6 và HN 2.9) và Moina sp.. - Tương tự, sau khi phân tích 160 mẫu Moina sp., Bekker et al., (2016) nhận thấy ranh giới địa lý chính xác của các loài/nhóm Moina sp. - Có thể với lượng mẫu lớn hơn, các dòng/ loài Moina sp. - Trong nghiên cứu này, phương pháp định danh Moina sp. - III (8,33%) và IV (0,02%) có thể là những loài Moina sp chưa được công bố trình tự mtCOI trên NCBI.. - Để có thể đánh giá đầy đủ hơn tính đại diện của các loài Moina sp. - trong khu vực cũng như tìm được nhóm/dòng Moina sp. - có ưu thế về sức tăng trưởng và hàm lượng dinh dưỡng để chọn lọc và thuần hóa phục vụ cho công tác ương nuôi động vật thủy sản cần triển khai việc thu thập thêm mẫu Moina spp. - Ngoài ra, đối với các nhóm Moina sp. - Hiện nay, các cặp mồi PCR đặc hiệu dùng để định danh các loài Moina sp. - Do đó, dựa trên sự khác biệt của trình tự gen mtCOI giữa các nhóm/loài Moina sp., các cặp mồi đặc hiệu cho từng nhóm/loài cần được thiết kế để định danh nhanh và chính xác hơn.