- GEN EG707, MỘT ĐÁNH DẤU PHÂN TỬ TRIỂN VỌNG ĐỂ KIỂM TRA SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH. - TRÊN CÂY CỌ DẦU. - Trong nghiên cứu này, gen Eg707 được phân lập từ tế bào nuôi cấy treo đã được khảo sát đặc tính phân tử. - Kết quả phân tích Southern cho thấy Eg707 có thể là đơn gen trong bộ gen của cây cọ dầu. - Gen Eg707 biểu hiện gen rất cao ở tế bào của mô được nuôi cấy hơn là ở những tế bào sinh dưỡng, điều đó chứng tỏ Eg707 có thể đóng góp trong quá trình hình thành phôi vô tính hay là trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển phôi. - Kỹ thuật lai RNA in situ một lần nữa chứng minh gen Eg707 được biểu hiện trong suốt giai đoạn phát triển phôi, sự biểu hiện gen bắt đầu từ sự hình thành phôi, từ giai đoạn callus đến giai đoạn phôi trưởng thành. - Bởi vì sự hình thành mầm phôi trong thời kỳ callus phát sinh phôi là một trong những nhân tố chính cho sự phát triển phôi vô tính của cây cọ dầu, nên Eg707 có thể được đề nghị như là một đánh dấu phân tử để kiểm tra sự hình thành phôi vô tính ở giai đoạn đầu của cây cọ dầu.. - Từ khóa: cọ dầu, phiên bản mới, Eg707, đánh dấu phân tử, phôi vô tính. - Cọ dầu (Elaeis guineensis Jacq.) là cây một lá mầm có giá trị kinh tế quan trọng vì là cây cung cấp dầu ăn lớn nhất trên thế giới (Ahmad et al., 2008). - Cây cọ dầu có sản lượng dầu cao nhất trên một hecta so với tất cả các loại cây có dầu (Gorret et al., 2004) và năng suất dầu trung bình cho một hecta có thể lên đến 4.08 tấn. - nhiên, trong xu hướng phát triển công nghiệp dầu cọ ở thế kỷ 21 gặp phải những thách thức làm thế nào để duy trì ở thế cạnh tranh và lợi nhuận của cây cọ dầu trong điều kiện lao động ít và đất đai bị giới hạn (Parveez et al., 2000). - Do đó, để đáp ứng được nhu cầu dầu cọ của thế giới, việc cải thiện năng suất cũng như chất lượng dầu cọ trong thời gian ngắn là vấn đề cần làm (Sambanthamurthi et al., 2009). - Tuy nhiên, việc cải thiện giống bằng con đường lai tạo theo phương pháp cổ điển thì rất lâu vì một chu kỳ phóng thích ra được một giống cọ dầu mang đặc tính mong muốn cũng mất gần 10 năm. - Chiến lược cải thiện giống bằng lai tạo sẽ tốn nhiều công lao động và mất thời gian vì chu kỳ phát triển của cây dài và không có nhân giống tự nhiên được bằng vô tính và tính hỗn tạp trong lai tạo cao (Staritsky, 1970. - Jouannic et al., 2005). - Hơn thế nữa, những giống cọ dầu trồng hiện tại lại có nguồn gốc từ một nguồn gen hẹp, điều đó rất khó cho những người chọn giống tạo giống mới trong điều kiện nguồn gen bị giới hạn (Parveez et al., 2000). - Do đó, ngành công nghệ dầu cọ tìm ra một phương pháp mới để nhân nhanh những cây bố mẹ có đặc tính tốt cho việc sản xuất hạt và những dòng tốt làm cây con để cung cấp cho thị trường (Basri et al., 2005).. - Nhân những dòng tốt bằng phương pháp nhân giống vô tính của cây cọ dầu được nghiên cứu từ nhiều năm qua và là phương pháp triển vọng để cải thiện năng suất cây cọ dầu (Gorret at el., 2004). - Theo Willis et al. - (2008), những vườn cọ dầu được trồng từ những cây có đặc tính tốt từ nuôi cấy mô cho năng suất tăng lên khoảng 30% và rút ngắn thời gian cho trái. - Để nhân nhanh giống cọ dầu bằng phương pháp nhân giống vô tính, nuôi cấy tế bào treo (giai đoạn hình thành phôi) được nghiên cứu và tận dụng trong những thập niên qua (Gorret et al., 2004;. - Tarmizi et al., 2004). - Tuy nhiên, việc hình thành callus từ vật liệu nuôi cấy thì rất thấp, khoảng 19% (Corley và Tinker, 2003), trong khi tỉ lệ trung bình của việc hình thành phôi từ những callus sinh sôi chỉ đạt cao nhất là 6% (Wooi, 1995).. - (2008) cho rằng nhân giống vô tính bằng con đường nuôi cấy mô cho cây cọ dầu tốn nhiều thời gian và công lao động trong giai đoạn phòng thí nghiệm. - Vì thế, quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô của cây cọ dầu cần phải cải thiện. - Để loại bỏ những trở ngại trên, đánh đấu phân tử cho quá trình hình thành phôi được nghiên cứu ở mức độ phân tử cho việc phát hiện những mô tốt, phát hiện quá trình hình thành callus và phôi, để việc nhân giống vô tính của cây với một lượng lớn (Low et al., 2006). - Sự phát hiện sớm khả năng tạo callus và hình thành phôi vô tính có thể giúp giảm chi phí và thời gian trong tiến trình nuôi cấy mô cây cọ dầu. - Về khía cạnh này, số lượng lớn thư viện cDNA của cây cọ dầu đã được thành lập (Jouannic et al., 2005. - Ho et al., 2007. - Low et al., 2008) thì rất hữu ích cho việc xác định gen, sự biểu hiện gen, tìm ra được đầy đủ đoạn cDNA (Boonanuntanasarn, 2008), tìm ra những đánh đấu phân tử (Rudd, 2003). - Tuy nhiên, có rất nhiều gen mới hiện diện rất lớn trong thư viện những đoạn gen được biểu hiện (EST). - Thí dụ như, Low et al. - Thêm vào đó, những EST có thể rất quan trọng trong việc tìm ra những chu trình của các phản ứng sinh hóa hay quá trình điều khiển sự phát triển của cây (Fristensky et al., 1999). - của nghiên cứu này là khảo sát đặc tính phân tử của gene Eg707 từ EST của tế bào nuôi cấy treo của cây cọ dầu. - Đây là một kết quả sơ khởi cho thấy gen Eg707 biểu hiện rất cao ở giai đoạn nuôi cấy tế bào treo, có thể nó có sự ảnh hưởng rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy mô của cây cọ dầu.. - Đoạn biểu hiện gen (Expressed sequence tag, EST) dòng Eg707 được phân lập trước đó từ tế bào nuôi cấy treo của cây cọ dầu (Ooi, 2003) và được đưa lên ngân hàng gen (Acc. - Lá non, mô phân sinh, rể, hoa cái, tế bào nuôi cấy treo, callus không tạo phôi, callus tạo phôi vô tính, phôi hữu tính của cây cọ dầu và EST dòng được cung cấp bởi viện nghiên cứu dầu cọ Malaysia (MPOB).. - Phân tích chuỗi trình tự được thực hiện sử dụng dụng cụ Basic Local Alignment Search Tool 2.0 (BLAST 2.0) (Altschul et al., 1997). - DNA từ lá non của cây cọ dầu được ly trích bằng phương pháp cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (Murray và Thompson, 1980) và được cắt với bốn enzyme cắt giới hạn: HindIII, NotI, EcoRI và TaqI (Fermentas, Germany). - RNA tổng số từ những bộ phận của cây cọ dầu (lá non, mô phân sinh, rể, hoa cái, tế bào nuôi cấy treo, callus không tạo phôi và callus tạo phôi vô tính) được ly trích bằng phương pháp SDS-phenol/LiCl (Shizadegan et al., 1991). - Xác định lượng biểu hiện gen bằng phương pháp so sánh C T (Livak và Schmittgen, 2001). - Mức độ biểu hiện gen ở các mẩu được so sánh với mẩu được ly trích từ tế bào nuôi cấy treo. - Biểu hiện gen của glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) trong cọ dầu được sử dụng làm gen chuẩn (Acc. - Bảy giai đoạn phát triển của phôi vô tính (callus phôi, không phải callus phôi, tế bào nuôi cấy treo, phôi dạng hình cầu, phôi dạng hình ngư lôi, giai đoạn nẩy mầm, giai đoạn nhiều phôi) và phôi hữu tính ở 15 tuần tuổi sau khi thụ phấn (15 WAA) được cố định trong EAF (50% (v/v) cồn, 5% (v/v) acetic acid, 10% (v/v) formaldehyde, 35% (v/v) nước) trong tủ hút. - Lai in situ được thực hiện phương pháp Coen (1990) và Jackson (1991) đã được chỉnh sửa cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm (Coen et al., 1990. - 3 KẾT QUẢ. - Để xác định những phiên bản của gen Eg707 chứa trong bộ gen của cây cọ dầu, DNA được phân lập từ lá cây cọ dầu được sử dụng trong phân tích Southern. - Hình 1: Dự đoán đấu hiệu vận chuyển từ nhân ra tế bào chất (a) và đoạn bảo tồn liên họ aldehyde oxidase, xanthine dehydrogenase và molybdopterin binding (Ald- Xan-dh-C2) (từ amino acids 29 đến 89) (b) trong chuỗi amino acid của Eg707. - Qua kết quả phân tích từ Southern cho thấy gen Eg707 có thể là đơn gen trong bộ gen của cây cọ dầu.. - 3.3 Phân tích biểu hiện gen bằng phương pháp real-time PCR. - Kết quả phân tích real time PCR (Hình 3) cho thấy mức độ biểu hiện gen của Eg707 rất thấp ở lá, mô phân sinh, rễ và không có sự biểu hiện ở hoa cái. - Có thể gen này không có vai trò trong sự phát triển của tế bào sinh trưởng và sinh dục.. - Trong những vật liệu nuôi cấy mô, thì sự biểu hiện của gen này rất cao trong tế bào nuôi cấy treo và giảm dần trong tế bào hình thành phôi vô tính và tế bào không hình thành phôi vô tính. - Kết quả này cho thấy gen Eg707 đóng một vai trò quan trọng trong sự hình thành phôi vô tính và phát triển của tế bào nuôi cấy treo của cây cọ dầu.. - 3.4 Phân tích biểu hiện gen bằng phương pháp lai RNA in situ. - Lai RNA in situ được thực hiện cho các mẫu thí nghiệm có sự biểu hiện gen Eg707 cao từ kết quả real time PCR và các mẫu ở các giai đoạn phát triển khác nhau của việc hình thành phôi vô tính và hữu tính của cây cọ dầu. - Con dò xuôi và con dò ngược đều được sử dụng trong thí nghiệm này và vị trí biểu hiện gen được xác định bằng những dấu hiệu chỉ có từ con dò ngược (Hình 4). - RNA thông tin của Eg707 được phát hiện trong tất cả các tế bào ở giai đoạn đầu hình thành phôi và chỉ được thấy ở một số vị trí nhất định ở phôi trong một vài giai đoạn của quá trình hình thành phôi. - Trong giai đoạn hình thành phôi của callus (Hình 4Ab), sản phẩm phiên mã của Eg707 đươc phát hiện ở những tế bào mà chúng có thể hình thành những tế bào phân sinh ở giai đoạn sau này. - Kết quả lai cho thấy những tế bào phân sinh dạng phân chia được nhuộm và có màu xanh đậm.. - Hình 2: Phân tích Southern cho cây cọ dầu được rửa trong điều kiện tối hảo. - Sự sao chép này nằm ở vùng ngoại biên của những callus không hình thành phôi (Hình 4Bb) hơn là biểu hiện hết tất cả các tế bào của callus hình thành phôi, điều đó cho thấy sự biểu hiện của gen Eg707 thì cao hơn trong tế bào hình thành phôi và chỉ biểu hiện ở vòng ngoài của những callus không hình thành phôi. - Ở tế bào nuôi cấy treo của cây cọ dầu (Hình 4Cb), sự phiên mã được phát hiện ở những tế bào đang phân chia, điều này cho thấy kết quả lai được nhuộm bằng màu xanh đen ở nhân. - Song song đó, kết quả phân tích mô học của mô phân sinh, ở callus hình thành phôi và ở những tế bào nuôi cấy treo, nơi mà gen Eg707 biểu hiện rất cao, đều cho kết quả của sự phát triển mô là giống nhau. - Trong giai đoạn hình thành phôi dạng hình cầu, đó là giai đoạn đầu của sự phát triển phôi vô tính của cây cọ dầu và chúng được cấy chuyền qua môi trường không có chất kích thích sinh trưởng (Hình 4Db), kết quả lai nhận thấy một tín hiệu rất yếu của gen Eg707 được biểu hiện ở những tế bào vòng ngoài của phôi, là những tế bào cho sự phân sinh ngọn, là một lớp đơn xung quanh phôi. - Đặc biệt, sự biểu hiện gen Eg707 được quan sát trong giai đoạn hình thành nhiều phôi từ quá trình hình thành phôi vô tính (Hình 4Gb) và hình thành phôi hữu tính (Hình 4Hb). - Trong sự hình thành phôi vô tính, dấu hiệu nằm ở vị trí những tế bào phân sinh cũng như những tế bào dự trữ tinh bột trong phôi vô tính, sự biểu hiện gen thì thấy ở vòng ngoài, là phần mà những tế bào phân sinh sẽ hình thành.. - Chuỗi amino acid của Eg707 được dự đoán có chứa dấu hiệu vận chuyển từ nhân ra ngoài tế bào chất. - Hình 3: Biểu hiện gen Eg707 ở các mẫu thí nghiệm của cây cọ dầu được so sánh với mẫu nuôi cấy tế bào treo. - N: đối chứng, SC: tế bào nuôi cấy treo, E: callus phôi, NE:. - callus không hình thành phôi, L: lá, R: rễ, ME: mô phân sinh, FF: hoa cái. - Mẫu thí nghiệm của cọ dầu Biểu hiện gen của Eg707 ở các mẫu thí nghiệm được so sánh với mẫu tế bào nuôi cấy treo. - đó là một điều cơ bản để xác định sự tồn tại của tế bào (Cour et al., 2004). - Haasen et al. - Đoạn bảo tồn liên họ Ald-Xan-dh-C2 trên chuỗi amino acid của Eg707 cũng có trên protein abscisic aldehyde oxidase 3 (AAO3), protein này cũng được tìm thấy có ở cây cỏ tai chuột (Seo et al., 2000. - González-Guzmán et al., 2004). - tương tự đoạn bảo tồn này cũng được tìm thấy trong protein aldehyde oxidase (AO) của cây bắp (Sekimoto et al., 1997) và của cây lúa mạch (Omarov et al., 1998). - Câu hỏi đặt ra ở đây là phải chăng protein Eg707 có liên quan đến quá trình tổng hợp ABA và ảnh hưởng đến quá trình phát triển của trong một số bộ phận của cây cọ dầu.. - Nhìn chung, gen Eg707 trong tế bào nuôi cấy treo biểu hiện cao (khoảng gấp 2 lần) hơn trong những callus hình thành phôi và những callus không hình thành phôi (Hình 4). - Điều này cho thấy gen này biểu hiện suốt trong quá trình hình thành callus và biểu hiện tăng lên trong tế bào nuôi cấy treo. - Sự biểu hiện của gen này giống như sự biểu hiện của gen AtSERK1 (A. - thaliana somatic embryogenesis receptor kinase 1), chỉ biểu hiện ở giai đoạn hình thành phôi (Shah et al., 2001).. - Giống kết quả nghiên cứu sự biểu hiện gen DcECP31, DcECP40, DcECP63 từ cà rốt và AtECP31, AtECP63 từ cây cỏ tai chuột (chúng mã hóa protein LEA (late embryogenesis abundant)) chỉ biểu hiện trong vật liệu nuôi cấy mô, những gen này được biết liên quan đến quá trình hình thành và phát triển của phôi (Chugh và Khurana, 2002).. - Kết quả lai RNA in situ cho thấy sự biểu hiện gen của Eg707 bắt đầu từ giai đoạn callus phôi đến sự phát triển của phôi vô tính. - Từ lúc hình thành phôi trong giai đoạn callus phôi là một trong những nhân tố đầu tiên để phát triển phôi vô tính của cây cọ dầu. - Từ những kết quả trên, gen Eg707 có thể sử dụng như là một đánh dấu phân tử để sớm phát hiện sự hình thành phôi vô tính. - Thêm vào đó, sự biểu hiện gen của Eg707 được phát hiện trong cả phôi vô tính và phôi hữu tính, do đó Eg707 đóng vai trò trong sự hình thành phôi nói chung chứ không chỉ trong giai đoạn hình thành phôi vô tính hay chỉ trong giai đoạn phôi hữu tính. - Nói một cách gián tiếp, thì sự phát triển phôi vô tính gần giống như sự phát triển phôi hữu tính. - Tuy nhiên, sự hình thành ban đầu thì không giống nhau. - Eg707 chỉ biểu hiện trong suốt quá trình hình thành phôi vô tính, điều này rất thú vị cho việc nghiên cứu gen khởi động và vùng điều khiển trong đoạn gen Eg707 để làm sáng tỏ cơ chế điều khiển sự biểu hiện của gen này.. - Từ những kết quả trên cần có những nghiên cứu tiếp theo để tìm hiểu sự tác động của gen Eg707 trên những gen khác và xác định cụ thể protein Eg707 phụ trách giai đoạn nào trong quá trình hình thành phôi vô tính.. - Hình 4: Vị trí biểu hiện gen Eg707 trong vật liệu nuôi cấy mô của cây cọ dầu và phôi hữu tính. - Hình (c) và (d) chỉ vùng vị trí đánh dấu mô học đã được dung phân tích và những hình ảnh lai RNA in situ cho mỗi loại tế bào. - B callus không hình thành phôi. - C tế bào nuôi. - D phôi ở giai đoạn hình cầu. - E giai đoạn hình ngư lôi. - F giai đoạn nẩy mầm. - G giai đoạn nhiều phôi vô tính. - Oil Palm Industry Economic J