Ảnh hưởng của chiết xuất ổi (Psidium guajava) và diệp hạ châu (Phylanthus amarus) lên đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

- ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT ỔI (Psidium guajava) VÀ DIỆP HẠ CHÂU (Phylanthus amarus) LÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO BẠCH CẦU CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus).
- Cá tra, diệp hạ châu, miễn dịch, ổi, tế bào bạch cầu Keywords:.
- Do đó, nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ảnh hưởng của chiết xuất ethanol từ lá ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chiết xuất giữa chúng (1:1) lên tế bào bạch cầu cá tra.
- Các tế bào bạch cầu (5×10 6 tế bào/mL) thu từ máu ngoại vi và thận của cá tra được bổ sung chiết xuất riêng lẻ từ lá ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chiết xuất lá ổi: diệp hạ châu tại 2 nồng độ khác nhau (10 và 100  g/mL) trong 24 giờ nuôi cấy..
- Kết quả cho thấy chiết xuất từ lá ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chiết xuất có tác động tích cực đến các chỉ tiêu miễn dịch được khảo sát.
- Cụ thể, hoạt tính lysozyme và tổng kháng thể của các nghiệm thức có bổ sung chất chiết xuất tăng đáng kể so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05).
- Tuy nhiên, hoạt tính reactive oxygen species (ROS) chỉ tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức có bổ sung chiết xuất lá diệp hạ châu (100  g/mL) và nghiệm thức có bổ sung hổn hợp chiết xuất lá ổi: diệp hạ châu (10  g/mL) đối với tế bào bạch cầu thận..
- Tương tự, hoạt tính nitric oxide synthases (NOS) của tế bào bạch cầu thu từ thận tăng đáng kể sau khi được bổ sung 100  g/mL chất chiết xuất lá ổi.
- Ngoài ra, hỗn hợp chiết xuất lá ổi:.
- Ảnh hưởng của chiết xuất ổi (Psidium guajava) và diệp hạ châu (Phylanthus amarus) lên đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).
- Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tượng thuỷ sản chủ lực được nuôi phổ biến ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).
- Dung et al., 2008).Vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng là các tác nhân gây bệnh phổ biến thường gặp và gây tổn thất nặng nề trên cá tra (Crumlish et al., 2002.
- Phan et al., 2009).
- Hiện nay, một trong những phương pháp kiểm soát dịch bệnh đầy hứa hẹn là tăng cường hệ miễn dịch cá (Raa et al., 1992).
- Nhóm tác giả Sirimanapong et al.
- (2014) đã thử nghiệm cảm nhiễm chủng vi khuẩn nhược độc Aeromonas hydrophila bằng cách tiêm vào gốc vây ngực cá tra nhằm kích thích tăng cường hoạt tính miễn dịch như: hoạt tính thực bào, respiratory burst, bổ thể, lysozyme, peroxidase, tổng kháng thể Ig và kháng thể đặc hiệu IgM.
- Ngoài ra, việc bổ sung một số chất kích thích miễn dịch vào chế độ cho ăn cá tra như: Escherichia coli lipopolysaccharide, levamisole và β-glucan hoặc bổ sung probiotic (Bacillus amyloliquefaciens 54A và Bacilus pumilus 47B) cũng làm tăng cường đáng kể hoạt tính respiratory burst, lysozyme, bổ thể, anti-proteas, hiệu giá kháng thể và tổng protein.
- Sirimanaponget al., 2015a.
- Gần đây, một số nghiên cứu được thực hiện để đánh giá tính khả thi của việc sử dụng chiết xuất từ thảo dược trong quản lý dịch bệnh cá khi được bổ sung vào chế độ cho ăn hàng ngày, nhằm thúc đẩy tăng cường hệ miễn dịch không đặc hiệu của chúng (Harikrishnan and Balasundaram, 2008.
- Ravikumar et al., 2010;.
- Harikrishnan et al., 2012).
- Thông thường, những chất chiết xuất thảo dược này chứa nhiều thành phần khác nhau (alkaloids, steroid, phenolics, tannin, terpenoids, saponin và flavonoid) và thể hiện hoạt tính sinh học khác nhau (Awaad and Al-Jaber, 2010;.
- Talpur et al.
- Gobi et al.
- (2016) cũng chứng minh rằng chiết xuất từ lá ổi (P.
- Tuy nhiên, cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu trên chỉ tìm hiểu ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược trong chế độ ăn đối với một số chỉ tiêu miễn dịch ở các loài cá khác nhau, có rất ít thông tin về cơ chế hoạt động của các chất chiết xuất từ thực vật đối với các tác dụng kháng viêm hoặc kích thích miễn dịch trong các tế bào cá.
- Ngoại trừ nghiên cứu của Sen et al.
- (2015) về chất flavonoid chiết xuất từ lá cây ổi (P.
- Do đó, bài báo này trình bày kết quả ảnh hưởng của chất chiết xuất từ lá ổi (P.
- amarus) lên đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá tra nhằm đưa ra giả thuyết về hiệu quả ban đầu của chất chiết xuất từ thảo dược trên tế bào bạch cầu cá tra trước khi ứng dụng chúng trong thí nghiệm in vivo.
- Hơn nữa, thí nghiệm trên tế bào còn làm giảm đáng kể thời gian và số lượng động vật thí nghiệm giúp giảm chi phí khi chọn lọc chất chiết xuất cho ứng dụng ngoài thực tế..
- Chiết xuất ethanol từ ổi và diệp hạ châu được thực hiện bởi Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần thơ.
- Chiết xuất sau khi thu được hoà tan hoàn toàn trong DMSO 100%.
- (1968) và Pierrard et al.
- Ficoll Paque PLUS (1,077 g/mL, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) được sử dụng để phân lập tế bào bạch cầu.
- Thí nghiệm bao gồm 12 nghiệm thức được bổ sung chất chiết xuất (tế bào bạch cầu thu từ thận và tế bào bạch cầu thu từ máu ngoại vi được bổ sung 3 loại chất chiết xuất trên tại 2 nồng độ 10 và 100 μg/ml) và 2 nghiệm thức đối chứng (tế bào bạch cầu thu từ thận và tế bào bạch cầu thu từ máu ngoại vi được bổ sung 1% DMSO), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
- Sau 24 giờ bổ sung chất chiết xuất, tế bào của các nghiệm thức được phá vỡ bằng 50 μl hỗn hợp dung dịch (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Triton x 100 0,1%, PMSF 0,1 μg/mL), ly tâm 2.000 g trong 10 phút.
- lysodeikticus được cho vào đĩa 96 giếng, hoạt tính lysozyme được đo tại bước sóng 450 nm từ 0 đến 10 phút.
- Mẫu được ủ ở 28 o C trong 120 phút, sau đó đo ở bước sóng 405 nm để tính hoạt tính bổ thể.
- (iv) Hoạt tính reactive oxygen species (ROS) được xác định theo qui trình của Rook et al.(1985).
- (v) Sản xuất nitric oxide synthases (NOS) được đo bởi phản ứng Griess (Devi et al., 2012).
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả hoạt tính lysozyme.
- Sau 24 giờ bổ sung chất chiết xuất, hoạt tính lysozyme ở các nghiệm thức dao động từ 125-340 U/mL đối với bạch cầu thu từ máu và 505- 1072 U/mL đối với bạch cầu thu từ thận cá tra, có sự gia tăng hoạt tính lysozyme ở các nghiệm thức có bổ sung chiết xuất thực vật so với đối chứng (Hình 1)..
- Trong đó, tăng cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 100 μg/mL chiết xuất ổi và 10 μg/mL hỗn hợp chiết xuất lá ổi:diệp hạ châu đối với bạch cầu thận.
- và 10 μg/mL mỗi loại chất chiết xuất đối với bạch cầu máu (P<0,05).
- Nhìn chung, bạch cầu thận có hoạt tính lysozyme cao hơn bạch cầu thu từ máu giữa các nghiệm thức.
- Ngoài ra, hỗn hợp chiết xuất lá ổi:diệp hạ châu cũng làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme tại nồng độ thấp (10 μg/mL) trên cả hai loại bạch cầu máu và thận (P<0,05).
- Như vậy, chiết xuất từ lá ổi và diệp hạ châu có ảnh hưởng tích cực đến hoạt tính lysozyme của tế bào bạch cầu cá tra.
- Nghiên cứu gần đây của Giri et al.
- chất chiết xuất ổi vào khẩu phần ăn trong 60 ngày..
- mossambicus) sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung chất chiết xuất ổi trong 30 ngày (Gobi et al., 2016)..
- Chiết xuất ethanol từ diệp hạ châu có chứa alkaloid, flavonoid, polyphenol, terpenes và terol (Amonkan et al., 2013), những hợp chất này có xu hướng ức chế hoạt tính phân huỷ trong cơ thể (Rohn et al., 2002).
- Trong khi đó, alkaloid, tannin, flavonoid, phenolic flavonoid, axit ascorbic là những thành phần chủ yếu có trong chiết xuất ethanol ổi (Anbuselviand Rebecca, 2017).
- Đặc biệt là phenolic flavonoid, flavonoid và tannin trong ổi có khả năng kháng khuẩn và chống oxi hoá (Saravanakumar et al., 2009).
- Điều này giải thích hoạt tính lysozyme ở nghiệm thức có bổ sung chất chiết xuất ổi cao hơn nghiệm thức có bổ sung chất chiết xuất diệp hạ châu..
- Hình 1: Hoạt tính lysozyme (U/mL) của tế bàobạch cầu thu từ máu và thận cá tra sau 24 giờ bổ sung chiết xuất ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chất chiết xuất tại 2 nồng độ 10 và 100 g/mL 3.2 Kết quả hoạt tính bổ thể.
- Sau 24 giờ bổ sung chất chiết xuất thảo dược, hoạt tính bổ thể ở hầu hết các nghiệm thức không khác biệt có ý nghĩa thống kê (Hình 2).
- Ngoại trừ nghiệm thức có bổ sung 100 μg/mL của hỗn hợp chất chiết xuất ổi và diệp hạ châu cho cả hai loại tế bào bạch cầu máu và thận so với đối chứng.
- Mặc dù hoạt tính lysozyme gia tăng làm kích hoạt tăng hoạt tính bổ thể thông qua quá trình opsonin hoá (Ogundele, 1998), tế bào bạch cầu cũng không cho kết quả tăng đáng kể hoạt tính bổ thể sau khi bổ sung chất chiết xuất lá ổi.
- Kết quả này cũng tương tự với kết quả nghiên cứu in vivo từ chiết xuất ổi cũng giúp cá cải thiện hoạt tính bổ thể (Giri et al., 2015.
- Gobi et al., 2016).
- Hình 2: Hoạt tính bổ thể (U/mL) của tế bào bạch cầu thu từ máu và thận cá tra sau 24 giờ bổ sung chiết xuất ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chất chiết xuất tại 2 nồng độ 10 và 100 g/mL 3.3 Hoạt tính ROS.
- Kết quả phân tích sau 24 giờ nuôi cấy cho thấy rằng, chỉ có nghiệm thức được bổ sung 100 μg/mL chiết xuất lá diệp hạ châu và 10 μg/mL hỗn hợp chất.
- gây bệnh (Neumann et al., 2001, Rao et al., 2006)..
- mossambicus) được cho ăn chế độ ăn có bổ sung chiết xuất ổi cũng làm tăng có ý nghĩa thống kê hoạt tính ROS sau 30 ngày.
- Một nghiên cứu khác của Fawole et al.
- (2016) cũng chứng minh rằng hoạt tính ROS cũng tăng đáng kể ở các nhóm cá trôi Ấn Độ (L.
- Như vậy, chất chiết xuất lá ổi và diệp hạ châu có khả năng giúp cải thiện hoạt tính ROS nhằm chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh, đồng thời cũng hỗ trợ làm tăng cường hệ miễn dịch không đặc hiệu trong tế bào bạch cầu cá tra..
- Hình 3: Hoạt tính ROS (mg NBT/mL) của tế bào bạch cầu thu từ máu và thận cá tra sau 24 giờ bổ sung chiết xuất ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chất chiết xuất tại 2 nồng độ 10 và 100 g/mL 3.4 Hoạt tính NOS.
- Hoạt tính NOS chỉ tăng có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức tế bào bạch cầu thận bổ sung 100 μg/mL chiết xuất lá ổi sau 24 giờ nuôi (P<0,05) (Hình 4).
- Tương tự ROS, NOS cũng có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các chức năng miễn dịch và trực tiếp chống lại tác nhân gây bệnh (Olivier et al., 1985).
- Ilangkovan et al.
- (2016) cũng chứng minh rằng tế bào đại thực bào người cũng tăng hoạt tính NOS sau khi bổ sung chiết xuất diệp hạ châu.
- Ngoài ra, huyết tương tôm sú (Penaeus monodon) cũng tăng hoạt tính NOS sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung 0.2%.
- chiết xuất ổi (Yin et al., 2014).
- Tuy nhiên, khẩu phần ăn được bổ sung chiết xuất ổi làm ức chế hoạt tính NOS trong thận của cá trôi Ấn Độ (Giri et al., 2015)..
- Hình 4: Hoạt tính NOS (M Nitrit) của tế bào bạch cầu thu từ máu và thận cá tra sau 24 giờ bổ sung chiết xuất ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chất chiết xuất tại 2 nồng độ 10 và 100 g/mL.
- Chiết xuất lá ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chiết xuất có tác dụng kích thích làm tăng hoạt tính tổng kháng thể sau 24 giờ ở cả 2 loại bạch cầu (Hình 5)..
- Tuy nhiên, tổng kháng thể của tế bào bạch cầu thu từ thận cao hơn bạch cầu thu từ máu.
- Đối với tế bào.
- bạch cầu thận, tổng kháng thể tăng đáng kể ở hầu hết các nghiệm thức có bổ sung chiết xuất thảo dược so với đối chứng (P<0,05).
- Một số nghiên cứu gần đây cũng chứng minh rằng hàm lượng tổng kháng thể tăng mạnh sau khi bổ sung chất chiết xuất vào thức ăn của cá (Mo et al., 2016.
- Safari et al., 2017;.
- Hoseinifar et al., 2018.
- Jahanjoo et al., 2018)..
- Hình 5: Tổng kháng thể Ig (mg protein/mL) của tế bào bạch cầu thu từ máu và thận cá tra sau 24 giờ bổ sung chiết xuất ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chất chiết xuất tại 2 nồng độ 10 và 100 g/mL 4 KẾT LUẬN.
- Chất chiết xuất thảo dược có tác dụng kích thích hoạt tính miễn dịch tế bào (ROS, NOS), miễn dịch không đặc hiệu (lysozyme, bổ thể) và đặc hiệu tế bào (tổng kháng thể) tế bào bạch cầu máu và thận cá tra sau 24 giờ.
- Tuy nhiên, mức độ gia tăng của các hoạt tính miễn dịch này tuỳ thuộc vào chất chiết xuất, nồng độ bổ sung và loại tế bào nuôi cấy (tế bào bạch cầu phân lập từ máu hoặc thận).
- Cụ thể, chiết xuất lá ổi và hỗn hợp chất chiết xuất (10 μg/ml) giúp làm tăng hoạt tính lysozyme tế bào bạch cầu thận và máu.
- Hỗn hợp chất chiết xuất (10 μg/ml) kích thích sự gia tăng của hoạt tính lysozyme, ROS và tổng kháng thể của tế bào bạch cầu thu từ thận cá tra.
- Tại nồng động cao (100 μg/mL), chiết xuất lá ổi, diệp hạ châu và hỗn hợp chiết xuất cũng làm tăng hàm lượng tổng kháng thể Ig của thế bào bạch cầu thận.
- Ngoài ra, hoạt tính lysozyme, ROS, NOS và tổng kháng thể từ tế bào thu từ thận cá tra cho kết quả cao hơn tế bào BC thu từ máu ngoại vi..
- Nghiên cứu này chỉ tập trung vào tìm hiểu đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá tra sau khi bổ sung chất chiết xuất.
- Do vây, cần tiếp tục nghiên sự ảnh hưởng bổ sung chất chiết xuất lá ổi và diệp hạ.
- Amonkan, A.K., Kamagaté, M., Yao, A.N., et al., 2013.
- Giri, S.S., Sen, S.S., Chi, C., et al., 2015.
- Gobi, N., Ramya, C., Vaseeharan, B., et al., 2016..
- Phan, L.T., Bui T.M., and Nguyen T.T.T., et al., 2009.
- Sirimanapong, W., Adams, A., Ooi, E.L., et al., 2015a.
- Sirimanapong, W., Thompson, K.D., Ooi, et al., 2015b.
- Thy, H.T.T., Tri, N.N., Quy, O.M., et al., 2017.