- ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ CHÍN CÀ CHUA VÀ NỒNG ĐỘ NaCl ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY PECTIN. - Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly pectin methylesterase (PME) từ cà chua được thực hiện nhằm xác định điều kiện trích ly PME cho hiệu suất và hoạt tính cao. - Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch muối NaCl và độ chín đến khả năng trích ly PME được khảo sát, đồng thời chế độ bảo quản PME thô thích hợp giúp duy trì hoạt tính của enzyme cũng được xác định. - Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nồng độ dung dịch muối NaCl 1,25M và độ chín khởi phát (breaker) cho hoạt tính PME cao nhất. - Ước tính hoạt tính tổng PME đạt 6566 U cho 100g nguyên liệu cà tươi (tương đương khoảng 65000 U/kg nguyên liệu cà tươi). - Sau thời gian tồn trữ 21 ngày, PME giảm 36% hoạt tính ở nhiệt độ trữ đông -30 o C và giảm đến 69% hoạt tính trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ 4 o C.. - Fachin, 2002…) đều cho thấy cà chua là một nguồn PME thực vật có nhiều ưu điểm: hoạt tính khá mạnh, dễ trích ly, phương pháp đơn giản, nguyên liệu dồi dào và rẻ tiền. - Vì vậy, vấn đề tối ưu hóa quá trình trích ly PME từ cà chua phục vụ nghiên cứu và sản xuất được đặt ra.. - Một độ chín khác đáng quan tâm trong quá trình chín của cà chua là quá chín, vì vậy khảo sát thêm hoạt tính PME trên cà quá chín để so sánh với các độ chín khác là cần thiết. - Tiến hành trích ly PME từ puree cà dựa trên phương pháp Wicker có sửa đổi (mục 2.2.2). - 2.2.2 Phương pháp trích ly PME từ cà chua. - Qua một số thí nghiệm thăm dò cho thấy quá trình trích ly PME theo phương pháp Wicker (1992) vượt trội về hiệu quả trích ly cũng như độ tinh sạch của enzyme.. - Phương pháp này rất thích hợp cho việc trích ly PME từ thực vật. - Thí nghiệm thăm dò còn chỉ ra rằng hiệu quả trích ly và hoạt tính của PME vẫn được duy trì khi sử dụng phương pháp Wicker với một số thông số kỹ thuật được thay đổi. - Quy trình trích ly theo phương pháp Wicker sửa đổi được tổng hợp ở (Hình 1).. - Hình 1: Quy trình trích ly PME thô từ cà chua theo phương pháp Wicker (1992) có sửa đổi. - 2.2.3 Phương pháp đo hoạt tính PME. - Hoạt tính của PME được xác định bằng phương pháp chuẩn độ liên tục gốc carboxyl giải phóng ra từ dung dịch pectin (Crelier et al., 1995) bằng cách sử dụng thiết bị chuẩn độ tự động pH – Stat và dung dịch NaOH 0,01 N. - Hoạt tính của enzyme PME được xác định thông qua việc ghi liên tục thể tích NaOH chuẩn dùng để trung hòa lượng carboxyl được giải phóng trong dung dịch, trong khoảng thời gian 5 phút ở nhiệt độ phản ứng là 30 o C. - Cà chua Đồng hóa Trích ly PME. - Thời gian trích ly qua đêm. - Đơn vị hoạt tính của PME được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1mol carboxyl trong một phút, theo các điều kiện phản ứng ở trên.. - 2.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl trong dịch trích ly đến khả năng trích PME từ cà chua. - Trích ly PME từ cà chua (độ chín hoàn toàn) với tám nồng độ muối NaCl (trong đệm phosphate 1/15M, pH 8,0) và mẫu đối chứng (chỉ trích ly bằng dung dịch đệm). - Tiến hành đo hoạt tính bằng phương pháp chuẩn độ điện thế. - Chọn nồng độ muối tối ưu để hiệu suất trích ly (U/ 100 g nguyên liệu cà chua) và hoạt tính riêng PME (U/mL dịch trích) cao nhất.. - 2.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng mức độ chín của cà chua đến khả năng trích ly PME Khảo sát thực hiện ở cả 6 mức độ chín, xác định theo tiêu chuẩn phân loại cà chua của USDA (1991) từ xanh (thuần thục), chín khởi phát (Breaker), chín 1/3 (chuyển chín), chín 2/3 (hồng), chín hoàn toàn (đỏ sáng và đỏ) và quá chín.. - Trích ly PME ở sáu mức độ chín bằng phương pháp Wicker có sửa đổi (mục 2.2.2) thu được PME thô. - Tiến hành đo hoạt tính bằng phương pháp chuẩn độ điện thế.. - Chọn lựa loại cà chua có độ chín phù hợp cho hiệu suất trích ly (U/ 100 g nguyên liệu cà chua) và hoạt tính riêng PME (U/mL dịch trích) cao nhất.. - 2.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nhiệt độ tồn trữ đến hoạt tính riêng của PME cà chua Nhiệt độ tồn trữ PME cà chua được khảo sát ở hai mức độ: làm lạnh 4 o C và lạnh đông -30 o C.. - Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzyme theo thời gian tồn trữ tùy thuộc nhiệt độ tồn trữ.. - Hoạt tính xác định trong quá trình tồn trữ bằng phương pháp chuẩn độ điện thế.. - Chọn chế độ tồn trữ thích hợp để giữ hoạt tính riêng PME (U/mL) tốt nhất.. - 3.1 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến khả năng trích ly PME. - Muối NaCl giữ vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trích ly PME từ thực vật.. - NaCl trích ly tương ứng. - Chính vì thế, việc khảo sát lại ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến khả năng trích ly PME từ cà chua được trồng và thu hoạch từ vườn cà ở Vũng Liêm (Vĩnh Long) được thực hiện. - Hiệu quả của quá trình trích ly PME theo nồng độ muối NaCl khác nhau (từ 0 2M) được đánh giá dựa trên hoạt tính tổng (U/100g) và hoạt tính riêng (U/mL), kết quả được tổng kết ở (Bảng 1).. - Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl trong dung dịch trích ly đến hoạt tính của PME từ thịt quả cà chua. - Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại. - Từ kết quả ở bảng 1 cho thấy, quy luật biến đổi của hoạt tính tổng và hoạt tính riêng theo nồng độ dung dịch muối NaCl trích ly là như nhau. - Hoạt tính cũng như hiệu suất trích ly PME từ cà chua gia tăng ứng với nồng độ muối NaCl sử dụng tăng dần theo dãy từ 0 M đến 1,25 M. - Khi nồng độ NaCl sử dụng vượt quá 1,25 M, hiệu quả trích ly PME lại giảm. - Có thể nói, 1,25 M là ngưỡng nồng độ tối thích của NaCl đối với quá trình trích ly PME từ cà chua. - Vì vậy, PME cho kết quả khả quan ở những nồng độ dung dịch muối trích ly cao. - Trường hợp không sử dụng muối NaCl (mẫu đối chứng) cho hoạt tính PME thấp nhất nhưng vẫn có sự hiện diện của enzyme. - Tuy nhiên, sử dụng muối NaCl nồng độ cao cũng là nguyên nhân làm giảm hoạt tính của PME. - Tóm lại, hiệu quả trích ly PME cũng như sự thay đổi hoạt tính của enzyme này chịu sự chi phối của nồng độ muối NaCl trong dung dịch trích ly. - Trong trường hợp trích ly PME từ cà chua được mua tại Vũng Liêm (Vĩnh Long), hiệu quả trích ly cũng như hoạt tính của PME thu được cao nhất ở giá trị nồng độ muối NaCl sử dụng là 1,25M.. - 3.2 Ảnh hưởng của sự thay đổi độ chín của cà chua đến khả năng trích ly PME Độ chín (hay mức độ thuần thục của quả) có ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng cũng như hoạt tính PME thực vật. - Kết quả được đánh giá dựa trên sự thay đổi hoạt tính tổng và hoạt tính riêng của PME từ cà chua ở các mức độ chín khác nhau, tổng hợp ở (Bảng 2).. - Bảng 2: Biến thiên hoạt tính PME trích ly theo độ chín. - Mẫu Độ chín Hoạt tính riêng (U/mL) Hoạt tính tổng (U/100g) 1. - Từ kết quả thí nghiệm ở bảng 2 có thể nhận thấy rằng, hoạt tính riêng của PME cao nhất tại độ chín khởi phát (breaker). - Không có sự khác biệt nào giữa hoạt tính riêng PME ở các độ chín 1/3, 2/3, chín hoàn toàn và quá chín. - Giai đoạn quả xanh thể hiện hoạt tính riêng PME thấp nhất. - Đồng thời, có sự giảm nhẹ hoạt tính riêng ở độ chín 1/3 so với dãy độ chín tăng dần về sau. - Ảnh hưởng của mức độ chín đến hoạt tính tổng PME cũng có qui luật tương tự như hoạt tính riêng.. - PME thể hiện hoạt tính riêng cao nhất ở giai đoạn chín khởi phát, nguyên nhân chính có lẽ phụ thuộc vào số lượng isozyme có mặt trong giai đoạn này. - Sự tích lũy PME1 và PME2 làm cho giai đoạn chuyển chín khởi phát (breaker) tích trữ một lượng lớn PME nên sự thể hiện hoạt tính cao nhất, phản ánh đúng sinh hóa quá trình chín tự nhiên của quả. - (1991) khi nghiên cứu trên cà (giống Rutger) cũng cho thấy rằng PME thể hiện hoạt tính ngay khi quả chưa thuần thục và tăng lên hai hay ba lần trong suốt quá trình chín. - Hoạt tính tăng song song với hàm lượng PME. - Tuy nhiên, khi vượt qua khỏi giai đoạn chuyển chín thì hoạt tính giảm, hàm lượng tiếp tục tăng (Harriman et al.,1991). - Điều này có thể làm giảm nhẹ hoạt tính trong giai đoạn đầu quả chín (chín 1/3). - Càng về sau do sự tích lũy của PME2 nên hoạt tính tăng nhẹ trở lại ở độ. - Điều này cũng lý giải cho giá trị hoạt tính tổng bằng nhau tại hai độ chín khởi phát (breaker) và 2/3. - Trích ly PME từ thịt quả cà còn xanh thu phần lớn PME và ít enzyme PG. - Các isozyme của PME đều có mặt trong cà còn xanh, trong khi đó PG không thể hiện hoạt tính cho đến khi quá trình chín trở nên mạnh mẽ (Pressey và Avants, 1982. - Đỉnh cao hoạt tính PME nằm trong vùng chín 1/3 (pink) là vùng quá trình chín được nhận thấy rõ ràng. - Ở giai đoạn chuyển chín của nghiên cứu này, tuy hoạt tính PE không là cao nhất nhưng hoạt tính của một loạt các enzyme khác như PG, β-galactanase thể hiện ở mức thấp nhất. - Một điểm có lợi khi chọn độ chín khởi phát cho trích ly PME là do lượng PG hoạt động ít. - Khi quả chín hoàn toàn và quá chín, sự tích lũy các đơn vị polygalacturonide là chất ức chế PME nên làm giảm hoạt tính PME.. - Như vậy, tổng kết thí nghiệm 1 và 2 cho thấy quá trình trích ly PME tốt nhất ở nồng độ dung dịch muối NaCl 1,25M và cà chua đạt độ chín khởi phát (breaker).. - Việc trích ly được PME có hoạt tính cao không chỉ dừng lại ở dạng PME thô mà còn có ý nghĩa trong việc sử dụng dài lâu. - Việc tồn trữ PME và duy trì hoạt tính như ban đầu nhằm sử dụng cho các mục đích tinh sạch, nghiên cứu hay thương mại được đặt ra. - Vì vậy, cần đề ra chế độ tồn trữ thích hợp nhằm làm giảm sự tổn thất hoạt tính ở mức thấp nhất.. - 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tồn trữ đến hoạt tính riêng của PME cà chua. - Hoạt tính riêng PME (u/ml) -30C 4C. - Hình 2: Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian tồn trữ đến hoạt tính riêng của PME cà chua. - Kết quả ở hình 2 cho thấy có sự khác biệt về khả năng duy trì hoạt tính PME ở 2 chế độ tồn trữ. - Hoạt tính PME nhìn chung thể hiện ở mức cao nhất sau một ngày trích ly và đều giảm dần theo thời gian ở hai chế độ tồn trữ. - suy giảm hoạt tính rõ rệt khi về cuối giai đoạn khảo sát (Hình 2). - Tác dụng tủa của ammonium sulfate là thuận nghịch nên protein PME chỉ tạm thời mất hoạt tính. - Trường hợp bảo quản lạnh đông PME, mặc dù hoạt tính của PME cũng tăng trong ngày thứ nhất nhưng có giá trị thấp hơn so với bảo quản lạnh. - Vì vậy, ở ngày thứ nhất bảo quản, PME bảo quản lạnh thể hiện hoạt tính cao hơn PME bảo quản lạnh đông.. - Tuy nhiên, mức độ duy trì hoạt tính của PME trong điều kiện bảo quản lạnh đông tỏ ra hiệu quả hơn khi so sánh mẫu bảo quản lạnh. - Sau 21 ngày tồn trữ ở chế độ mát 4 o C, hoạt tính PE giảm 69% so với hoạt tính cao nhất của ngày thứ nhất. - Bảng 3: Độ giảm hoạt tính PME theo điều kiện bảo quản mát và lạnh đông. - Hoạt tính. - hoạt tính. - Chữ số in đậm thể hiện sự giảm hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại. - Sự giảm hoạt tính nhanh nhất của tồn trữ lạnh là ở giai đoạn 14 ÷ 21 ngày. - Ở thời điểm này, hoạt tính của PME giảm một nửa so với thời điểm sau trích ly. - Tuy nhiên, ở chế độ tồn trữ đông, mức độ giảm hoạt tính chậm hơn, không có sự giảm mạnh hoạt tính được nhận ra (Hình 2 và Bảng 3).. - Khi khảo sát khả năng trích ly PME lần lượt tại 9 nồng độ dung dịch NaCl từ 0 2M, hoạt tính riêng và hoạt tính tổng PME cao nhất tại nồng độ dịch trích 1,25M.. - Trích ly PME ở 6 độ chín khác nhau từ mức độ xanh. - (thuần thục), khởi phát (breaker), chín 1/3, chín 2/3, chín hoàn toàn và quá chín, hoạt tính PME đạt giá trị cao nhất ở độ chín khởi phát. - Ước tính hoạt tính tổng PME đạt khoảng 65000 U/kg nguyên liệu cà chua tươi. - nhiệt độ lạnh đông -30 o C và nhiệt độ lạnh 4 0 C, PME thể hiện hoạt tính cao nhất ở ngày tồn trữ đầu tiên và duy trì hoạt tính đến thời gian khảo sát 21 ngày. - Sau 21 ngày bảo quản, hoạt tính PME giảm 36% ở nhiệt độ tồn trữ -30 o C và giảm 69% ở chế độ 4 o C.