- Nghiên cứu thực hiện nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của việc bổ sung levamisole vào thức ăn lên sự đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cá tra. - Levamisole được bổ sung vào thức ăn cho cá tra ở nhiều nồng độ khác nhau và 450 mg/kg thức ăn) trong thời gian 4 tuần. - Cá thí nghiệm được cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm xoang bụng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở tuần thứ 4 sau khi bổ sung levamisole. - tổng bạch cầu, các loại bạch cầu bao gồm bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính ở nhóm bổ sung levamisole tăng cao hơn so với nghiệm thức đối chứng.. - Các chỉ tiêu miễn dịch, hoạt tính lysozyme và bổ thể tăng cao có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ sung 300 mg/kg thức ăn so với các nghiệm thức còn lại sau 2 tuần bổ sung (p<0,05). - Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá giảm nhẹ ở tuần thứ 4 sau khi bổ sung levamisole. - Sau khi cảm nhiễm, tỉ lệ chết thấp nhất của cá được tìm thấy ở nghiệm thức bổ sung 300 mg/kg thức ăn, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05).. - Nghiên cứu cho thấy, bổ sung levamisole vào thức ăn cá tra với nồng độ 300 mg/kg thức ăn có thể làm gia tăng đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá và bảo vệ cá tra kháng với vi khuẩn E. - Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nuôi phổ biến và có thế mạnh xuất khẩu ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). - Thí nghiệm bổ sung levamisole vào thức ăn cho cá làm gia tăng các chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu như số lượng tế bào bạch cầu, hoạt tính lysozyme, hoạt tính bổ thể, hoạt tính chống oxy hóa. - Tuy nhiên, hiện tại chưa có một nghiên cứu hay báo cáo về việc xác định hàm lượng levamisole bổ sung thông qua thức ăn để nâng cao đáp ứng miễn dịch, tăng cường khả năng kháng bệnh của cá tra tại Việt Nam. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thí nghiệm bổ sung levamisole. - Thí nghiệm bổ sung levamisole Sigma) được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức và 450 mg levamisole/kg thức ăn), lặp lại 3 lần. - Thu mẫu máu vào tuần thứ 2 và thứ 4 sau khi cá được cho ăn thức ăn có bổ sung levamisole. - Mỗi lần thu 9 cá/nghiệm thức. - 2.2 Thí nghiệm cảm nhiễm. - Sau 4 tuần bổ sung levamisole, cá thí nghiệm được cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 10 nghiệm thức, trong đó, mỗi nghiệm thức của thí nghiệm bổ sung levamisole được chia thành 2 nghiệm thức nhỏ, một sử dụng làm đối chứng (tiêm 0,1 ml NaCl 2 ) và một sử dụng để cảm nhiễm vi khuẩn (tiêm 0,1 ml E. - Thí nghiệm bố trí 45 cá/nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. - Sau 3 ngày gây cảm nhiễm thu 9 cá/nghiệm thức để phân tích các chỉ tiêu huyết học, hoạt tính lysozyme và bổ thể. - Mật độ loại bạch cầu (tb/mm 3. - Xác định hoạt tính lysozyme (Ellis et al.,1990).. - Tổng hồng cầu: Sau 2 tuần bổ sung levamisole, mật độ hồng cầu ở các nghiệm thức dao động từ x 10 6 tb/mm 3 , có sự gia tăng mật độ hồng cầu ở các nghiệm thức bổ sung levamisole so với nghiệm thức đối chứng, trong đó tăng cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 300 và 450 mg/kg, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). - Ở thời điểm 4 tuần sau khi bổ sung levamisole, mật độ hồng cầu ở các nghiệm thức bổ sung levamisole x 10 6 tb/mm 3 ) cao hơn nghiệm thức đối chứng (1,65 x 10 6 tb/mm 3. - Riêng nghiệm thức 5 (450 mg/kg), mật độ hồng cầu (1,67 x 10 6 tb/mm 3 ) giảm so với tuần thứ 2 (1,95 x 10 6 tb/mm 3 ) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). - Sau 3 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, mật độ hồng cầu của cá tăng nhẹ so với cá trước khi cảm nhiễm, trong đó cá ở nghiệm thức có bổ sung levamisole tăng cao hơn cá ở nghiệm thức đối chứng, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).. - Tương tự, ở thí nghiệm bổ sung levamisole với nhiều mức khác nhau và 500 mg/kg) vào thức ăn cho cá chép ăn trong 70 ngày. - Kết quả cho thấy mật độ hồng cầu tăng cao ở các nghiệm thức cá chép được bổ sung levamisole, trong đó nghiệm thức (250mg/kg) tăng cao nhất và có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (Sajid et al., 2009).. - Tổng bạch cầu:. - Sau khi bổ sung levamisole, ở tuần thứ 2 tổng mật độ bạch cầu ở các nghiệm thức bổ sung đều tăng cao, các nghiệm thức bổ sung 150, 300 và 450 mg/kg cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05). - Trong đó, nghiệm thức NT4 (300 mg/kg) cho kết quả tổng bạch cầu tăng cao nhất (158,4 x10 3 tb/mm 3 ) và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (112,9 x 10 3 tb/mm 3 ) (p<0,05). - Ở tuần thứ 4, nồng độ bạch cầu ở các nghiệm thức bổ sung levamisole x 10 3 tb/mm 3 ) vẫn cao hơn nghiệm thức đối. - Tuy nhiên, nồng độ bạch cầu ở thời điểm này giảm nhẹ so với thời điểm 2 tuần bổ sung levamisole, ngoại trừ nghiệm thức đối chứng và NT 2 (50 mg/kg).. - Nghiệm thức 5 (450 mg/kg) cho kết quả tổng bạch cầu ở tuần 4 giảm nhiều nhất so với tuần thứ 2 (145,9 x 10 3 tb/mm 3. - Tương tự, tổng bạch cầu sau khi cảm nhiễm ở nghiệm thức bổ sung levamisole tăng hơn so với đối chứng, NT4 (300 mg/kg) tăng cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức 1 và 5 (Hình 1).. - tổng bạch cầu của nhóm cá được bổ sung levamisole (5g/kg cá) tăng cao gấp hai lần và có ý nghĩa thống kê với nhóm cá đối chứng. - Một nghiên cứu khác đã chỉ ra, bổ sung levamisole cho cá chép trong thời gian dài (70 ngày) làm giảm mật độ tổng bạch cầu có ý nghĩa thống kê so với cá đối chứng (Sajid et al., 2009). - Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng levamisole lên bạch cầu cá tra ở trên, tổng bạch cầu tăng sau 2 tuần bổ sung levamisole và giảm sau 4 tuần bổ sung. - (2009) cho biết nghiên cứu bổ sung levamisole trên cá chép ở các hàm lượng 125, 250 và 500 mg/kg thức ăn, sau đó cảm nhiễm với vi khuẩn Aeromonas hydrophila ở ngày 30 và 58 thì cho thấy tổng hồng cầu, tổng bạch cầu khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở nhóm bổ sung 250 mg levamisole/kg thức ăn.. - Hình 1: Tổng bạch cầu cá tra sau 2, 4 tuần khi bổ sung levamisole và sau cảm nhiễm với E. - ictaluri Các loại bạch cầu. - Sau 2 tuần bổ sung levamisole, bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính tăng cao ở các nghiệm thức được bổ sung levamisole (Bảng 1). - Nghiệm thức 5 (450 mg/kg) có mật độ bạch cầu đơn nhân thấp nhất (18,4 x 10 3 tb/mm 3 ) trong các nghiệm thức được bổ sung levamisole và không khác biệt với nghiệm thức đối chứng. - Tương tự, mật độ tế bào lympho và tiểu cầu cũng gia tăng ở các nghiệm thức được bổ sung levamisole, tuy nhiên không khác biệt thống kê so với nghiệm thức đối chứng. - Sau 4 tuần bổ sung levamisole, mật độ bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tế bào. - lympho và tiểu cầu vẫn tăng cao ở các nghiệm thức có bổ sung levamisole. - tế bào lympho và tiểu cầu khác biệt không có ý nghĩa ở tất cả các nghiệm thức (p>0,05). - Sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri, mật độ của 4 loại bạch cầu của tất cả các nghiệm thức tăng cao so với trước khi cảm nhiễm.. - Các loại bạch cầu đều gia tăng ở các nghiệm thức có bổ sung levamisole, trong đó NT 4 (300 mg/kg) tăng cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng.. - Bảng 1: Mật độ bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, lympho và tiểu cầu của cá tra ở tuần 2 và tuần 4 sau khi ăn thức ăn bổ sung levamisole (x10 3 tb/mm 3. - Nghiệm thức BC đơn nhân BC trung tính Lympho Tiểu cầu. - Sau 2 tuần bổ sung/ levamisole. - NT 2 (50mg/kg ab a a 5,7 ± 4,7 a NT 3 (150mg/kg b b a a NT 4 (300mg/kg b b a a NT 5 (450mg/kg a ab a a Sau 4 tuần bổ sung levamisole. - Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu của Perera và Pathiratne (2008) khi bổ sung levamisole cho cá chép Ấn Độ ở 2 mức 1,25 và 2,5 mg/l trong khoảng thời gian và 56 ngày, cho kết quả bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính tăng có ý nghĩa thống kê và tăng cao nhất sau khi cho ăn 42 ngày. - Mật độ tế bào lympho ở các nghiệm thức cho ăn levamisole tăng có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở hàm lượng 1,25 mg/l sau 42 và 56 ngày cho ăn. - Kết quả cho thấy bạch cầu trung tính của cá tăng có ý nghĩa ở nghiệm thức bổ sung 5 và 10 mg/l trong 18 ngày, bạch cầu đơn nhân tăng có ý nghĩa ở nghiệm thức bổ sung 3 mg/l trong cả 2 thời điểm 18 và 35 ngày, tế bào lympho tăng khi bổ sung 3 mg/l sau 35 ngày nhưng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).. - 3.2 Hoạt tính lysozyme. - có bổ sung levamisole tăng cao hơn so với đối chứng. - Sau 4 tuần bổ sung levamisole, hoạt tính lysozyme ở các nghiệm thức có bổ sung levamisole đều cao hơn nghiệm thức đối chứng, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). - Mặt khác, hoạt tính lysozyme ở tuần thứ 4 của tất cả các nghiệm thức đều giảm thấp so với lần thu mẫu ở tuần thứ 2 sau khi bổ sung levamisole (Hình 2). - Sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri, hoạt tính lysozyme tăng cao ở tất cả các nghiệm thức so với trước khi cảm nhiễm. - Các nghiệm thức bổ sung levamisole đều có hoạt tính lysozyme U/ml) tăng cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (119,6 U/ml), trừ nghiệm thức 5 (450 mg/kg) là 128,9 U/ml. - Hình 2: Hoạt tính lysozyme của cá sau 2, 4 tuần khi bổ sung levamisole và sau cảm nhiễm với E. - (2009) nghiên cứu bổ sung levamisole trên cá chép ở các hàm lượng và 500 mg/kg thức ăn và tiến hành thu mẫu ở ngày 0, 57 và 70 sau khi bổ sung levamisole. - Kết quả cho thấy hoạt tính lysozyme tăng cao nhất ở mức bổ sung 250 mg levamisole/kg thức ăn sau 57 ngày và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại. - Tuy nhiên, hoạt tính lysozyme giảm xuống ở lần thu mẫu 70 ngày sau khi bổ sung levamisole. - Điều này cho thấy, bổ sung levamisole trong thời gian dài có thể làm giảm hoạt tính lysozyme. - Một thí nghiệm khác đã báo cáo, bổ sung beta glucan, bovin lactoferine, chitosan, vitamin C và levamisole cho cá tra trong 2 tuần. - Kết quả cho thấy hoạt tính lysozyme của cá ở nghiệm thức bổ sung levamisole tăng cao nhất, có ý nghĩa thống kê so với hoạt tính lysozyme của cá ở các nghiệm thức còn lại (Hang et al., 2013b).. - Tuy nhiên, một nghiên cứu khác của Perera và Pathiratne (2008), bổ sung levamisole bằng phương pháp ngâm trên cá chép Ấn Độ ở 2 hàm lượng 1,25 và 2,5 mg/l trong các khoảng thời gian. - khác nhau và 56 ngày thì hoạt tính lysozyme tăng khác biệt sau 28 ngày bổ sung levamisole nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).. - 3.3 Hoạt tính bổ thể. - Hoạt tính bổ thể của cá ở các nghiệm thức bổ sung levamisole đều tăng cao so với nghiệm thức đối chứng ở 2 đợt thu mẫu: 2 và 4 tuần bổ sung levamisole (Hình 3). - Trong đó, nghiệm thức NT3 (150 mg/kg) và NT4 (300 mg/kg) tăng cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại trong cùng một đợt thu mẫu (p<0,05).. - Sau 4 tuần bổ sung levamisole, hoạt tính bổ thể ở các nghiệm thức đều giảm so với hoạt tính bổ thể ở lần thu mẫu tuần thứ 2, ngoại trừ nghiệm thức NT2 (50 mg/kg), tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). - Sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri, hoạt tính bổ thể tăng cao ở tất cả các nghiệm thức so với trước khi cảm nhiễm.. - Ngoài ra, hoạt tính bổ thể của các nghiệm thức có bổ sung levamisole cũng gia tăng hơn so với nghiệm thức đối chứng, tuy nhiên chỉ có NT3 (150 mg/kg) và NT4 (300 mg/kg) tăng cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p<0,05).. - Hình 3: Hoạt tính bổ thể của cá sau 2, 4 tuần khi bổ sung levamisole và sau cảm nhiễm với E. - ictaluri Kết quả hoạt tính bổ thể của thí nghiệm cũng. - Kết quả cho thấy hàm lượng chất chống oxy hóa, hàm lượng bổ thể trong máu tăng cao có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ sung levamisole 50 và 150 mg/kg. - Tuy nhiên, nồng độ oxy nguyên tử và hoạt tính bổ thể giảm ở nghiệm thức bổ sung levamisole liều cao hơn. - Tương tự, sau 2 tuần tiêm levamisole (5 mg/kg cá) vào cá tra cho thấy hoạt tính bổ thể tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm cá đối chứng (Hang et al., 2013b).. - 3.4 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn E. - Sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn E. - ictaluri, kết quả theo dõi cá trong 2 tuần ghi nhận cá ở nghiệm thức tiêm nước muối sinh lý (nghiệm thức đối chứng) khỏe mạnh và linh hoạt, không xuất hiện cá chết. - Trong khi tất cả các nghiệm thức cảm nhiễm với vi khuẩn đều xuất hiện cá chết sau 3 ngày cảm nhiễm. - Tỉ lệ chết ở các ngày sau khi cảm nhiễm cũng như thời gian cá ngưng chết có sự biến động giữa các nghiệm thức. - Cá chết nhiều nhất ở nghiệm thức bổ sung 0 và 450 mg/kg thức ăn và ở ngày thứ 5 sau cảm nhiễm. - Đến ngày thứ 7, 8 số lượng cá giảm chết và tất cả các nghiệm thức ngừng chết ở ngày thứ 9 sau cảm nhiễm.. - Hình 4: Tỉ lệ chết tích lũy của cá tra ở các nghiệm thức bổ sung levamisole sau khi cảm nhiễm với E. - Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm cho thấy tỉ lệ chết của cá ở các nghiệm thức bổ sung levamisole. - cho tỉ lệ chết thấp hơn cá ở nghiệm thức đối chứng, ngoại trừ nghiệm thức NT5 (450 mg/kg) (Hình 4).. - Nghiệm thức NT4 (300 mg/kg) có tỉ lệ chết thấp nhất (27%) so với các nghiệm thức còn lại, và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng NT1 (46,7. - (2009), nghiên cứu bổ sung levamisole cho cá chép và cảm nhiễm với vi khuẩn A. - hydrophila, kết quả cho thấy cá ở nghiệm thức bổ sung 250 mg levamisole/kg thức ăn có tỉ lệ chết thấp nhất.. - Kết quả PCR của mẫu cá ở các nghiệm thức cảm nhiễm với vi khuẩn E. - Cá tra được bổ sung thức ăn có chứa levamisole sau 2, 4 tuần cho thấy có sự kích thích đáp ứng miễn dịch thông qua việc gia tăng chỉ tiêu huyết học, hoạt tính lysozyme và bổ thể. - sung levamisole trong thời gian dài (4 tuần) cho thấy các chỉ tiêu miễn dịch giảm so với cá bổ sung levamisole trong 2 tuần. - Hàm lượng levamisole bổ sung ở mức 300 mg/kg thức ăn có khả năng kích thích hệ miễn dịch của cá tra và làm giảm tỉ lệ chết của cá khi cảm nhiễm với vi khuẩn E. - Tiếp tục nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian bổ sung levamisole lên hệ miễn dịch của cá tra.