- ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN SỰ CẢM ỨNG RỄ TƠ. - Tái sinh cây từ nuôi cấy rễ tơ qua quá trình biến nạp bằng Agrobacterium rhizogenes đã được thực hiện trên nhiều giống cây trồng. - Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của một số yếu tố như mật số tế bào trong huyền phù vi khuẩn, thời gian gây nhiễm, thời gian ủ cảm ứng, cường độ chiếu sáng và môi trường nuôi cấy lên quá trình biến nạp di truyền nhờ vi khuẩn A.. - Kết quả đã cho thấy mật số tế bào, thời gian gây nhiễm, thời gian ủ cảm ứng và môi trường nuôi cấy là các yếu tố quan trọng có thể kích thích sự hình thành rễ tơ ở các điều kiện thích hợp. - Lá dừa cạn ngâm trong huyền phù vi khuẩn có chỉ số OD 600 nm 0,2 trong 10 phút và ủ cảm ứng trên môi trường 1/2 White ở điều kiện tối trong 6 ngày cho hiệu quả hình thành rễ tơ cao nhất. - Việc chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang có tác động ức chế sự hình thành rễ tơ ở giai đoạn ủ cảm ứng nhưng lại có thể thúc đẩy quá trình này khi áp dụng ở bước loại bỏ vi khuẩn. - Các dòng rễ tơ chuyển gen đã được kiểm chứng nhờ kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên rolB.. - Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự cảm ứng rễ tơ cây dừa cạn (Catharanthus roseus) của chủng Agrobacterium rhizogenes C26. - Tế bào thực vật sau khi được chuyển gen sẽ phát sinh thành rễ tơ với nhiều đặc điểm nổi bật như tăng trưởng nhanh, ổn định về mặt di truyền và sinh hóa… nên được chú ý nhiều trong các lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của rễ, nhất là trong các nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp (Tzfira and Citovsky, 2008. - Cây được tái sinh có kiểu hình thay đổi tùy theo từng dòng rễ tơ khác nhau (Suza et al., 2008). - Đặc điểm của rễ tơ cũng như cây tái sinh từ rễ tơ phụ thuộc vào vị trí cũng như số lượng bản sao của gen được chèn vào bộ gen thực vật chủ (Chandra et al., 2013). - Chính vì vậy, việc thu nhận được nhiều dòng rễ tơ từ các loài hoa cảnh khác nhau bằng những chủng A. - Tuy nhiên, theo các báo cáo trước đây đã cho thấy hiệu quả cảm ứng tạo rễ tơ của A. - rhizogenes chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như mật số tế bào vi khuẩn trong huyền phù khi gây nhiễm, thời gian gây nhiễm, thời gian ủ cảm ứng, chế độ chiếu sáng, môi trường nuôi cấy. - Xu hướng tạo giống cây hoa cảnh mới, bao gồm cả cây dừa cạn, thông qua rễ tơ đang được xem là hướng nghiên cứu tiềm năng mang lại giá trị kinh tế cao. - Do đó, trong nghiên cứu này, các điều kiện cảm ứng tạo rễ được khảo sát nhằm góp phần hoàn thiện quy trình thu nhận rễ tơ từ cây dừa cạn để phục vụ cho nghiên cứu tạo giống cây. - Hình 1: Cây dừa cạn VIN077 in vitro 8 tuần tuổi 2.2 Gây nhiễm cảm ứng tạo rễ tơ. - Rễ tơ được hình thành sau 2-3 tuần gây nhiễm. - Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ. - là số mẫu hình thành rễ tơ/số mẫu gây nhiễm.. - 2.3 Xác nhận rễ chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Cắt lấy rễ tơ để ly trính DNA theo phương pháp cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (Porebski et al., 1997) xác định sự hiện diện của gen rolB (có nguồn gốc từ trên plasmid Ri của vi khuẩn) bằng cách khuếch đại các trình tự với cặp mồi chuyên biệt được thiết kế từ vùng gen rolB có sản phẩm khuếch đại là 430 bp có trình tự 5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’ và 5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’ (Skała et al., 2015). - rhizogenes nhiễm trong rễ tơ. - Mật độ tế bào vi khuẩn trong huyền phù dùng để gây nhiễm là một trong những yếu tố có tác động lên sự cảm ứng rễ tơ của A. - rhizogenes C26 cho thấy khi OD 600 nm của huyền phù vi khuẩn ở mức 0,2 thì tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ tăng lên có ý nghĩa (Bảng 1). - Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ ở OD 600 nm = 0,4 có tăng hơn so với ở OD 600 nm = 0,2, nhưng sự khác biệt này là không có ý nghĩa về mặt thống kê. - Khi OD 600 nm lên đến 0,6-1 thì tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ có xu hướng giảm dần. - (2013) khi cảm ứng rễ tơ trên cây kim sa (Arnica montana L.) bằng chủng A.. - rhizogenes ATCC15834 cho thấy kết quả cũng tương tự, khi tăng OD 600 nm lên đến 0,8 thì hiệu quả cảm ứng rễ tơ cũng tăng theo, tuy nhiên, khi tiếp tục tăng lên 0,9 thì không có sự khác biệt có ý nghĩa so với OD 600 nm = 0,8. - rhizogenes ATCC15834, sự cảm ứng rễ tơ từ cây rau sam (Portulaca oleracea) tăng theo OD 600 nm. - 0,2 đã xảy ra hiện tượng phát triển quá mức của vi khuẩn khi ủ cảm ứng gây ra thối úng mẫu hàng loạt và cuối cùng là làm giảm tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ. - Khi OD 600 nm càng cao không những không làm tăng tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ mà còn làm cho các mẫu rễ tơ thu được cũng khó loại nhiễm hết vi khuẩn dù sử dụng kháng sinh cefotaxime ở nồng độ cao (900 mg/l). - Bảng 1 : Ảnh hưởng của mật độ tế bào chủng Agrobacterium rhizogenes C26 lên tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ. - OD 600nm Tỷ lệ mẫu hình thành rễ. - rhizogenes C58C1 (Liu et al., 2011) dùng cảm ứng rễ tơ trên cây dừa cạn hay của chủng A. - rhizogenes ATCC15834 dùng cảm ứng rễ tơ trên cây kim sa (Petrova et al., 2013). - 3.2 Ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm Ngoài mật số tế bào trong huyền phù A.. - rhizogenes, thời gian gây nhiễm mẫu thực vật với huyền phù vi khuẩn cũng như thời gian ủ cảm ứng sau đó cũng là những yếu tố có ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ (Brijwal and Tamta, 2015;. - rhizogenes C26 có OD 600 nm 0,2 với thời gian khác nhau (Bảng 2). - Kết quả thu được cho thấy ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm có sự tương đồng với ảnh hưởng của mật số tế bào lên sự cảm ứng tạo rễ tơ. - Theo đó, khi tăng thời gian gây nhiễm từ 1 đến 10 phút thì tỷ lệ mẫu đáp ứng cũng tăng theo.. - Bảng 2: Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu với huyền phù chủng Agrobacterium rhizogenes C26 lên tỷ lệ mẫu hình thành rễ Thời gian gây nhiễm. - (phút) Tỷ lệ mẫu hình thành rễ. - Trước đây, nhiều báo cáo đã cho thấy thời gian gây nhiễm thích hợp tùy thuộc vào chủng vi khuẩn cũng như loài thực vật. - Cùng cảm ứng rễ tơ trên cây hoàng liên gai Ấn Độ (Berberis aristata DC. - thời gian gây nhiễm thích hợp là 4 giờ với chủng A.. - Kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy thời gian gây nhiễm thích hợp cho giống dừa cạn VIN077 với chủng A. - 3.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ cảm ứng Thời gian ủ cảm ứng là gian đoạn cần thiết trong phương pháp gây nhiễm trực tiếp A.. - Mỗi chủng vi khuẩn và mỗi loài thực vật chủ khác nhau sẽ có thời gian ủ cảm ứng cần thiết khác nhau. - rhizogenes ATCC15834, thời gian ủ cảm ứng thích hợp để thu nhận rễ tơ trên cây đậu phộng (Karthikeyan et al., 2007) và cây Duboisia myoporoides (Yoshimatsu et al., 2004) là 2 ngày trong khi trên cây giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (Chang et al., 2005) thì thời gian này là 2 tuần. - Thời gian thích hợp để. - cảm ứng tạo rễ chuyển gen bằng chủng A.. - Bảng 3: Ảnh hưởng của thời gian ủ cảm ứng lên tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ. - Thời gian ủ cảm ứng (ngày). - Tỷ lệ mẫu hình thành rễ. - Để xác định thời gian ủ cảm ứng thích hợp tạo rễ tơ chuyển gen từ mô lá dừa cạn VIN077 bằng chủng A. - rhizogenes C26, trong thí nghiệm này đã tiến hành thay đổi thời gian ủ cảm ứng từ 1 đến 7 ngày (Bảng 3). - Nhìn chung, kết quả thu được cho thấy tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ tăng theo thời gian ủ cảm ứng từ 1 đến 6 ngày. - Thời gian ủ cảm ứng dài hơn 6 ngày không những không làm tăng tỷ lệ mẫu hình thành rễ mà mẫu còn có biểu hiện chết do sự phát triển quá mức của vi khuẩn tương tự như báo cáo của Ho (1994). - Ngoài ra, kết quả quan sát cũng cho thấy một số mẫu rễ tơ cũng trở nên yếu hoặc chết khi kéo dài giai đoạn này. - Theo kết quả này thì thời gian ủ cảm ứng thích hợp cho việc cảm ứng rễ tơ từ mô lá của giống dừa cạn VIN077 là 6 ngày. - Thời gian này dài hơn so với cảm ứng rễ tơ từ mô sẹo cây dừa cạn bằng chủng A. - 3.4 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng trong giai đoạn ủ cảm ứng. - Vài báo cáo trước đây cho thấy ánh sáng có thể ảnh hưởng lên sự hình thành rễ tơ bởi A.. - rhizogenes ATCC15834, sự cảm ứng rễ. - Khả năng cảm ứng tạo rễ tơ của các chủng A. - rhzogenes A4s, A4v, AG1 và Arif cao nhất trên lát cắt củ cà rốt khi giai đoạn cảm ứng được ủ trong tối (Danesh et al., 2006). - rhizogenes PcA4, ATCC15834 và A4 rồi ủ cảm ứng trong tối, không có sự đáp ứng tạo rễ trên các mẫu mô từ cây Holostemma adakodien K. - Qua đó cho thấy cường độ chiếu sáng thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ có thể sẽ thay đổi tùy theo loài thực vật chủ và chủng vi khuẩn.. - Bảng 4: Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng trong thời gian ủ cảm ứng lên tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ. - (lux) Tỷ lệ mẫu hình thành rễ. - Trong nghiên cứu này, mẫu sau khi gây nhiễm được chiếu sáng ở các cường độ khác nhau với thời gian 16 giờ/ngày trong suốt giai đoạn ủ cảm ứng.. - Các kết quả thu được cho thấy tỷ lệ mẫu hình thành rễ đã bị giảm xuống có ý nghĩa ở tất các các chế độ chiếu sáng từ 500 đến 2000 lux (Bảng 4) so với khi được ủ cảm ứng trong tối. - Cường độ ánh sáng càng cao thì tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ càng giảm. - Tuy nhiên, kết quả này cho thấy ánh sáng chỉ ức chế một phần khả năng cảm ứng rễ tơ của chủng A. - rhizogenes C26 trên lá cây dừa cạn trong khi sự chiếu sáng trong giai đoạn ủ cảm ứng đã ức chế hoàn toàn khả năng cảm ứng rễ tơ của chủng A.. - Ngoài ra, so với báo cáo của Peebles (2008) và Hughes (2003), để tạo rễ tơ từ mô lá cây dừa cạn có thể cần phải có giai đoạn ủ cảm ứng trong tối hoàn toàn trước khi tiếp tục ủ cảm ứng ở chế độ chiếu sáng 16 giờ/ngày.. - rhizogenes C26, sự chiếu sáng nhẹ trong giai đoạn này đã làm tăng tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ. - Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ tăng từ 37,0% khi được ủ trong điều kiện tối lên 42,3% khi được ủ trong điều kiện sáng 1000 lux với 16 giờ/ngày (Bảng 5). - Thêm vào đó khi được chiếu sáng ở cường độ cao hơn, tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ tuy có xu hướng giảm hơn so với cường độ chiếu sáng 1000 lux nhưng sự khác biệt này là không có ý nghĩa về mặt thống kê. - Bảng 5: Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng trong thời gian loại nhiễm Agrobacterium rhizogenes C26 lên tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ. - 3.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Các báo cáo trước đây đã cho thấy mỗi giống thực vật và mỗi chủng vi khuẩn khác nhau có môi trường thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ khác nhau.. - rhizogenes ATCC15834 cảm ứng rễ tơ trên mô lá cây dừa cạn. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng cảm ứng tạo rễ tơ của chủng A. - Các số liệu thu được cho thấy ở tất cả các môi trường có nồng độ bán đậm đặc đều cho tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ cao hơn có ý nghĩa so với môi trường có nồng độ đậm đặc (Bảng 6). - Ở nồng độ đậm đặc, môi trường White cũng cho tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ cao hơn so với các môi trường đậm đặc còn lại (đạt 50,7%) nhưng vẫn thấp hơn nhiều so với ở môi trường White bán đậm đặc (đạt 60,7. - Kết quả thu được đã cho thấy môi trường White bán đậm đặc là môi trường thích hợp để cảm ứng tạo rễ từ mô lá cây dừa cạn bằng chủng A. - Kết quả này cũng một lần nữa cho thấy môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ của A. - Bảng 6: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ. - cấy Tỷ lệ mẫu hình thành rễ. - 3.7 Xác nhận rễ tơ chuyển gen bằng PCR Qua phân tích sản phẩm PCR (Hình 2) đã cho thấy các dòng rễ tơ được kiểm tra đều có chứa gen rolB tương ứng với đoạn DNA được khuếch đại với kích thước 430 bp. - rhizogenes nhưng không tìm thấy ở các mẫu rễ tơ. - Kết quả này chứng tỏ các dòng rễ tơ này đã được chuyển gen và. - giếng 1, 2 và 3: rễ tơ được cảm ứng. - giếng 1, 2 và 3: rễ tơ được cảm ứng bằng chủng A. - Quá trình chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ từ cây dừa cạn cũng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau. - Kết quả nghiên cứu này cho thấy sự cảm ứng tạo rễ tơ từ giống dừa cạn VIN077 bằng chủng A. - thời gian gây nhiễm, thời gian ủ cảm ứng, chế độ chiếu sáng và môi trường nuôi cấy. - Điều kiện gây nhiễm thích hợp để thu nhận rễ tơ từ giống dừa cạn VIN077 bằng chủng A. - rhizogenes C26 là OD 600 nm 0,2 với thời gian ngâm mẫu là 10 phút. - Tỷ lệ mẫu hình thành rễ đạt cao nhất khi mẫu được ủ cảm ứng 6 ngày trong tối và loại nhiễm vi khuẩn ở điều kiện chiếu sáng 1000 lux trên môi trường White bán đậm đặc.