- ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU KINALUX 25EC CHỨA HOẠT CHẤT QUINALPHOS LÊN HOẠT TÍNH MEN. - CHOLINESTERASE (CHE) CÁ TRA. - Nồng độ gây chết 50% cá trong 96 giờ (LC 50 -96 giờ) là 0,13 mg/l. - Thí nghiệm xác định khả năng hồi phục hoạt tính ChE của cá tra được bố trí ở 4 mức nồng độ quinalphos gồm và 75% giá trị LC 50 - 96 giờ được tiến hành với cá có khối lượng trung bình 14,3±1,36 g trong bể 100 l trong 28 ngày. - Sau 24 giờ tiếp xúc với quinalphos ở nồng độ 0,1 mg/l thì hoạt tính men ChE giảm ở não (-84,5. - Hoạt tính men ChE trên các cơ quan khảo sát theo các nồng độ phục hồi đến mức không khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (p<0,05) sau 28 ngày thí nghiệm. - trừ ChE não ở các nồng độ 50% và 75% giá trị LC 50 -96 giờ và cơ ở các nồng độ 75% giá trị LC 50 -96 giờ.. - Đa số nồng độ thuốc BVTV tồn tại trong môi trường ở mức dưới ngưỡng gây chết (Murty, 1988. - trích dẫn bởi Nguyễn Văn Công et al., 2006) và dư lượng thuốc gây hại cho sinh vật chủ yếu qua tác động lên hệ thần kinh thông qua ức chế hoạt tính men cholinesterase (Tomlin, 1994). - Nghiên cứu được triển khai tại trại thực nghiệm và phòng thí nghiệm Bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến Thủy sản – Khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ từ . - Thuốc trừ sâu sử dụng thuộc gốc lân hữu cơ có tên thương mại là Kinalux 25EC (chứa hoạt chất Quinalphos) có nồng độ hoạt chất là 250 g/L do Công ty United Phosphorus Ltd sản xuất.. - 2.2.2 Cá dùng trong thí nghiệm. - Cá tra có kích cỡ 14,3±1,36 g dùng thí nghiệm sẽ được mua từ Trại sản xuất giống Cần Thơ. - Cá mua về sẽ được thuần dưỡng trong bể lớn (kích cỡ 2 m 2 ) 7 ngày để cá ổn định và quen với điều kiện sống trong bể trước tiến hành thí nghiệm. - Trong thời gian thuần hóa và thí nghiệm cá được cho ăn 2 lần/ngày bằng thức ăn viên công nghiệp. - Cá chọn thí nghiệm có kích cỡ đồng đều và khỏe mạnh.. - Cá ở các kích cỡ 20 g, 50 g, 100 g, 200 g, 300 g dùng trong thí nghiệm xác định hoạt tính ChE theo kích cỡ cá được thu từ trại cá Hiệp Thanh – Thốt Nốt, Cần Thơ.. - Cá thu về được thuần dưỡng 7 ngày trong bể 500L để cá ổn định và quen với điều kiện sống trong bể thí nghiệm. - Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nước tĩnh (APHA, 2001) và không thay nước trong thời gian 96 giờ. - Thí nghiệm được tiến hành qua hai bước.. - Bước 1: thí nghiệm xác định khoảng gây độc (thí nghiệm thăm dò) được tiến hành với 9 mức nồng độ gồm 0. - Thí nghiệm đước tiến hành trong bể nhựa có lót nilon, bể có thể tích 60 L (chứa 50 L nước), cá có kích cỡ 14,3 (std=1,36) g/con) và mật độ là 10 con/bể.. - Trong thời gian thí nghiệm cá chết được ghi nhận vào các mốc thời gian là và 96 giờ. - Thí nghiệm này xác định nồng độ cao nhất gây chết không quá 10%. - cá sau 96 giờ và nồng độ thấp nhất gây chết khoảng 90% cá sau 1-2 giờ để làm khoảng nồng độ cho thí nghiệm tiếp theo. - Bước 2: thí nghiệm xác định giá trị LC 50 được tiến hành dựa vào kết quả ở bước 1, trong giới hạn nồng độ thuốc gây chết cá chia thành 6 mức nồng độ và 1 đối chứng (không có thuốc). - Theo dõi và ghi nhận số cá chết vào các mốc thời gian là và 96 giờ sau thí nghiệm. - Cá chết được vớt ra trong suốt thời gian thí nghiệm. - 2.3.2 Xác định khả năng hồi phục hoạt tính ChE của cá tra giống với Kinalux 25EC. - Sau khi xác định được giá trị LC 50 -96 giờ thì tiến hành bố trí thí nghiệm xác định khả năng hồi phục hoạt tính ChE của cá tra. - Thí nghiệm được bố trí ở 4 mức nồng độ quinalphos gồm và 75% giá trị LC 50 -96 giờ-trong bể nhựa lót nilon 100 L chứa 90 L nước. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại, mỗi bể bố trí 30 cá khỏe mạnh có kích cỡ 14,3 (std=1,36) g/con. - Thay 30% nước trong bể từ ngày thứ 4 và đến ngày thứ 7 thay 100% nước trong bể và sau đó thì mỗi 3 ngày thay 30% lượng nước trong bể đến khi kết thúc thí nghiệm.. - Khi thu cá dùng vợt thu nhẹ 6 cá và giết chết ngay bằng nước đá sau đó lấy não, gan, mang và cơ để đo hoạt tính của ChE. - 2.3.3 Thay đổi hoạt tính men ChE ở các kích cỡ cá khác nhau. - Cá tra có kích cỡ 20 g, 50 g, 100 g, 200 g và 300 g dùng trong thí nghiệm sẽ được thu từ trại cá Hiệp Thanh-Cần Thơ. - Cá mua về sẽ được thuần dưỡng 7 ngày trong bể 500 L để cá ổn định và quen với điều kiện sống trong bể thí nghiệm. - Cá chọn thí nghiệm có kích cỡ đồng đều và khỏe mạnh. - Thu 10 cá mỗi kích cỡ và giết chết ngay bằng nước đá sau đó lấy não, gan, mang và cơ để đo hoạt tính của ChE.. - Nồng độ độc tính cần thiết để giết chết một nửa cá thí nghiệm trong một thời gian nhất định - Giá trị LC 50 (mg/l) được xác định dựa vào phương pháp Probit (Finney, 1971). - Hoạt tính men xúc tác quá trình thủy phân chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholine - Cholinenesteras (nmoles/min/mg protein) được phân tích theo phương pháp của Ellman et al. - Trong thời gian thí nghiệm thì nhiệt độ chênh lệch trong ngày không quá 1 0 C. - Khi cho thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos vào các bể thí nghiệm thì cá bắt đầu chết nhiều trong 3-6 giờ tiếp xúc và số cá chết tỉ lệ thuận với nồng độ thuốc thí nghiệm từ 0 (đối chứng) đến nồng độ cao nhất là 0,35 mg/l. - 3.1.2 Ảnh hưởng của Kinalux 25EC đến khả năng hồi phục hoạt tính của men ChE trên cơ, gan, mang và não. - và nhiệt độ không khác biệt lớn giữa các nghiệm thức thí nghiệm. - Hoạt tính ChE trong não: hoạt tính men ChE trong não cá tỉ lệ nghịch với nồng độ và thời gian tiếp xúc thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos (Hình 1a). - Hoạt tính ChE trong não bị ức chế ở các nồng độ 0,013 mg/l. - 0,067 mg/l và 0,1 mg/l khi tiếp xúc với thuốc sau 6 giờ với mức độ hoạt tính lần lượt là 19,2%. - Từ ngày thứ 4 thì bể nuôi bắt đầu thay 30% nước và sau 7 ngày thay 100% nước nên độc tính thuốc trong môi trường giảm làm cho hoạt tính men ChE bắt phục hồi dần nhưng vẫn còn khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (p<0,05). - Ngày thứ 14 thì hoạt tính men ChE trong não bắt đầu phục hồi ở nồng độ thấp 0,013 mg/l và sai khác không ý nghĩa so với đối chứng. - Tuy nhiên, qua 28 ngày thì các nghiệm thức có nồng độ quinalphos 0,067 mg/l và 0,1 mg/l vẫn còn ở mức ức chế lần lượt là 8,76% và 24,2% và khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa (p<0,05) (Hình 1a).. - Hoạt tính ChE trong cơ: hoạt tính ChE trong cơ cá giảm mạnh khi tiếp xúc với quinalphos sau 6 giờ (Hình 1b). - Ở nồng độ 0,1 mg/l thì tỉ lệ ức chế là 82,2%. - Men ChE trong cơ ở các nồng độ 0,013 mg/l và 0,067 mg/l lần lượt phục hồi vào ngày thứ 7, 21 và không khác biệt ý nghĩa với đối chứng. - Tuy nhiên, đến ngày thứ 28 thì hoạt tính men ChE ở cơ của nghiệm thức nồng độ 0,1 mg/l vẫn chưa phục hồi hoàn toàn (còn bị ức chế 33,3%) (Hình 1b).. - Hoạt tính ChE trong mang: sau 24 giờ tiếp xúc với quinalphos thì hoạt tính men ChE trong mang bắt đầu giảm có ý nghĩa so với đối chứng (Hình 1c). - Mức độ ức chế lần lượt ở các nồng độ 0,013 mg/l. - Sau khi nước thí nghiệm được thay 100% (sau 7 ngày) thì đến ngày thứ 21 sự ức chế men ChE trong mang ở 2 nồng độ 0,013 mg/l và 0,067 mg/l phục hồi ở mức độ an toàn (<30%) và sau ngày thứ 28 mang ở cả 3 nồng độ thí nghiệm không khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (p<0,05) (Hình 1c).. - Hoạt tính ChE trong gan: hoạt tính ChE trong gan tuy thấp hơn rất nhiều so với hoạt tính ChE trong não, cơ và mang nhưng vẫn bị ảnh hưởng khi tiếp xúc với thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos (Hình 1d). - Men ChE bị ức chế mạnh và kéo dài đến ngày thứ 4 ở các mức độ 78,9%. - 76,5% và 79,4% tương ứng ở các nồng độ 0,013 mg/l. - 0,067 mg/l và 0,1 mg/l và phục hồi đến mức không khác biệt ý nghĩa so với đối chứng vào ngày thứ 10 ở nồng độ 0,013 mg/l. - và ngày thứ 21 đối với 2 nồng độ còn lại (Hình 1d).. - Hình 1: Hoạt tính men ChE ở (a) Não. - 3.1.3 Chỉ thị sinh học của cá tra giống đối với thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos Theo hình 2, ở cá có kích thước ≤100 g thì hoạt tính men ChE ở mang tuy có tăng ở các kích cỡ 20 g. - Tuy nhiên, hoạt tính men ChE mang ở cá 200 g và 300 g cao hơn có ý nghĩa so với cá 14,3 g (p<0,05). - Ở gan thì hoạt tính men ChE ở các kích cỡ 100 g. - Trong khi đó thì hoạt tính men ChE ở cơ thay đổi nhưng khác nhau không có ý nghĩa so với cá 14,3 g. - Tuy nhiên, ở não thì hoạt tính ChE tăng tỉ lệ thuận với sự gia tăng khối lượng cá thí nghiệm, sự gia tăng này có ý nghĩa thống kê (p<0,05).. - Hình 2: Hoạt tính men ChE theo kích cỡ cá (Ghi chú. - Cá tra có kích cỡ 14,3 g/con (std=1,36) thì trung bình hoạt tính ChE khi chưa tiếp xúc với quinalphos của cơ, mang, gan và não lần lượt là 130. - Sau 6 giờ tiếp xúc với nồng độ thuốc thí nghiệm cao nhất 0,1 mg/l (75% giá trị LC 50 -96 giờ) thì sự ức chế hoạt tính men ChE ở não (giảm 84,5. - Ở gan tại thời điểm 24 giờ tiếp xúc thuốc thì ở tất cả các nồng độ thí nghiệm đều bị ức chế trên 70% (Bảng 1).. - Như vậy, cá ở kích thước ≤100 g hoạt tính men ChE thay đổi theo hướng tăng nhưng không khác biệt ý nghĩa so với cá thí nghiệm kích cỡ nhỏ (14,3 g/con). - Mức độ ức chế men ChE ở trong nghiên cứu này có thể sử dụng như một chỉ thị sinh học khi trong môi trường có nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ hoạt chất quinalphos.. - Bảng 1: Thời điểm hoạt tính ChE ở các cơ quan cá bắt đầu chịu ảnh hưởng của thuốc trừ sâu quinalphos. - mức ức chế dưới 30. - mức ức chế dưới 70. - mức ức chế trên 70%. - Theo Das and Mukherjee (1999) thì men ChE trong não cá Labeo rohita bị ức chế 75,4% ở nồng độ quinalphos 1,12 mg/l. - Sau 1 ngày ở trong tình trạng thiếu oxy thì hoạt tính AChE trong não cá phi (Oreochromis mossambicus) giảm (28,8% đến 34,0% so với đối chứng) và sau 3-7 ngày thì hồi phục lại mức trước khi tiếp xúc điều kiện thí nghiệm (Pavlov, 1993). - Hoạt tính men AChE trong não cá Brycon cephalus khi tiếp xúc với methy parathion bị giảm 69% và có xu hướng tăng nhẹ sau 8 ngày thí nghiệm (Luciana et al., 2005). - Bên cạnh, thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ khác như diazinon làm hoạt tính men AChE ở não cá lóc (Channa striata) bị ức chế 82% sau 21 ngày gây nhiễm ở nồng độ 0,137 mg/L (std=0,019) trên ruộng lúa (Nguyen Van Cong et al., 2008). - So với giáp xác như tôm sú (Peneaus monodon) thì sau khi tôm tiếp xúc với thuốc trừ sâu hoạt chất endosulfan và deltamethrin thì hoạt tính AChE ở mang thay đổi không có có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (Tu et al., 2009). - Như vậy, hoạt tính ChE ở mang của cá nhạy cảm với độc tố của thuốc trừ sâu.. - Ở nồng độ 0,9 µ/L endosulfan và 0,07 µg/L deltamethrin thì sau 4 ngày tiếp xúc làm hoạt tính men AChE ở cơ tôm sú (Peneaus monodon) bị ức chế lần lượt 30%. - Hoạt tính men AChE trong cơ cá Brycon cephalus gây nhiễm methy parothion bị ức chế gần 64% nhưng cá vẫn sống sót và phục hồi 31%. - sau 8 ngày thí nghiệm và phục hồi trở lại bình thường sau 8 ngày (Luciana et al., 2005). - trong khi đó men AChE ở gan lại tăng không đáng kể trong thời gian thí nghiệm. - và AChE não tăng đáng kể trong suốt thời gian thí nghiệm (Peebua et al., 2007). - (2010) nhận thấy hoạt tính men AChE ở cơ và não cá Carassius auratus bị ức chế đáng kể bởi thuốc Chlorpyrifos và Isoprocarb và dạng kết hợp của chúng sau khi cá tiếp xúc 2, 5, 10, và 15 ngày.. - Hoạt tính men AChE ở não và cơ bị ức chế ở mức thấp hơn gan và mang khi cho cá Ictalurus punctatus tiếp xúc với S,S,S-tributyl phosphorotrithioate (David and Janice, 1994). - (1979) thì sự ức chế men AChE ở cá rô phi (Tilapia mossambica) khác nhau khi cho cá tiếp xúc với malathion ở nồng độ 2. - Hoạt tính men ChE ở não >. - sau khi tiếp xúc với quinalphos 24 giờ thì hoạt tính men ChE bị ức chế ở não (giảm 84,5%) >. - Men ChE trong các cơ quan ở các nồng độ phục hồi không khác biệt so với đối chứng sau 28 ngày thí nghiệm, trừ ChE não ở các nồng độ 50% và 75%. - giá trị LC50-96 giờ và cơ ở các nồng độ 75% giá trị LC50-96 giờ. - Có thể dùng hoạt tính ChE như là một đánh dấu sinh học chỉ môi trường bị ô nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ như quinalphos.. - Khi đánh giá sự ô nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ như quinalphos thì nên phân tích hoạt tính ChE ở mô não, cơ ở thời điểm 6 giờ và mang, gan ở thời điểm 24 giờ. - Ảnh hưởng của basudin 50EC lên hoạt tính enzyme cholinesterase và tăng trọng của cá lóc (Channa striata)