- KHÔNG ĐẶC HIỆU VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GÂY BỆNH CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus). - Nghiên cứu nhằm tìm hiểu sự ảnh hưởng của hàm lượng vitamin C đến khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá tra cũng như khả năng bảo hộ cá giống khi cảm nhiễm với vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Edwardsiella ictaluri. - Mẫu máu cá được thu sau 2 và 4 tuần bổ sung vitamin C để phân tích các chỉ tiêu huyết học, hoạt tính lysozyme và bổ thể. - Sau 4 tuần tiến hành gây cảm nhiễm với vi khuẩn E. - Kết quả cho thấy số lượng tế bào bạch cầu, hoạt tính lysozyme và bổ thể tăng nhẹ sau 2 tuần bổ sung vitamin C và tăng cao hơn sau 4 tuần. - Đặc biệt số lượng bạch cầu, hoạt tính lysozyme và bổ thể đạt mức cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 1000 mg vitamin C/kg thức ăn.. - Sau khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn, tỉ lệ chết của cá được bổ sung vitamin C (500 và 1000 mg/kg) thấp hơn so với tỉ lệ chết của cá ở nghiệm thức đối chứng.. - Những kết quả trên cho thấy bổ sung vitamin C ở mức 500-1000mg/kg thức ăn kích thích gia tăng một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu và tăng khả năng kháng vi khuẩn bảo vệ cá tra.. - Việc sử dụng thuốc và hóa chất bừa bãi sẽ gây ra nhiều trở ngại cho nghề nuôi như sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng nhiều, ô nhiễm môi trường nuôi, tồn lưu thuốc trên cá thương phẩm ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng. - Nghiên cứu này được thực hiện nhằm cung cấp thêm những thông tin hữu ít về sự ảnh hưởng của vitamin C lên sự đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và tỉ lệ sống ở cá tra giống khi cảm nhiễm với vi khuẩn.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thí nghiệm bổ sung Vitamin C. - trí thí nghiệm, cá được kiểm tra ngẫu nhiên về hình dạng, kí sinh trùng và vi khuẩn.. - Thí nghiệm bổ sung Vitamin C được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 1000 mg Vitamin C/kg thức ăn) và 3 lần lặp lại. - Tiến hành thu mẫu máu ở 2 thời điểm: 2 tuần và 4 tuần sau khi cá được cho ăn thức ăn có bổ sung vitamin C. - Mỗi lần thu 9 cá/nghiệm thức. - Trong quá trình phối trộn thức ăn, vitamin C sẽ được bổ sung với nồng độ: 50 mg, 500 mg và 1000 mg vitamin C/kg thức ăn bằng cách thay thế tỉ lệ bột mì trong công thức thức ăn. - Thức ăn sau khi chế biến được trữ ở 4 o C.. - Vi khuẩn cảm nhiễm là vi khuẩn E. - Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường NB, sau đó đem ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. - Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng là 610 nm. - Sau đó pha loãng vi khuẩn đến mật độ 10 5 cfu/ml để tiến hành cảm nhiễm cho cá. - Nhỏ 0,1 ml dung dịch vi khuẩn vừa pha lên đĩa TSA tán đều, đem ủ ở nhiệt độ 28 o C trong 48h để kiểm chứng mật độ vi khuẩn vừa pha. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 8 nghiệm thức bao gồm: NT 1 (0mg Vitamin C + NaCl). - Thí nghiệm bố trí 30 cá / nghiệm thức và mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. - Mỗi cá được tiêm 0.1ml vi khuẩn (10 5 cfu/ml) ở gốc vi ngực. - Dấu hiệu bệnh lý được ghi nhận, mẫu thận trước được trữ trong ethanol 90% để tái định danh vi khuẩn.. - 2.4 Qui trình PCR phát hiện vi khuẩn Vi khuẩn E.ictaluri được phát hiện theo phương pháp PCR được mô tả bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Trúc phương (2010). - 3.1 Kết quả định loại và định lượng các tế bào máu. - Hồng cầu: Kết quả định lượng hồng cầu cho thấy số lượng hồng cầu gia tăng sau 2 tuần cho ăn Vitamin C (Hình 1). - Số lượng hồng cầu ở nghiệm thức 4 (1000mg/kg) là 19x10 5 tb/mm 3 và nghiệm thức 3 (500 mg/kg) là 17.9x10 5 tb/mm 3 so với nghiệm thức đối chứng 15.7 x10 5 tb/mm 3 . - Tuy nhiên, sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa thống kê. - Sau 4 tuần bổ sung vitamin C, mặc dù kết quả hồng cầu ở các nghiệm thức có bổ. - sung vitamin C đều tăng cao hơn so đối chứng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0.05).. - Số lượng Hồng cầu (tế bào x 10^5/mm3) 2 tuần 4 tuần. - Hình 1: Số lượng hồng cầu của cá sau 2 và 4 tuần bổ sung Vitamin C. - Bạch cầu. - Hình dạng của các loại bạch cầu không có sự khác biệt giữa cá sử dụng thức ăn có và không bổ sung vitamin C (Hình 2).. - Hình 2: A: tế bào hồng cầu. - Tế bào bạch cầu trung tính (N). - Kết quả định lượng tổng bạch cầu cho thấy sau 2 tuần bổ sung vitamin C, tổng bạch cầu của cá ở nghiệm thức (500 và 1000 mg/kg) tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (Bảng 1). - Trong khi đó, nghiệm thức 50 mg/kg không khác biệt so với đối chứng. - Tương tự, sau 4 tuần bổ sung vitamin C, tổng bạch cầu của các nghiệm thức có sử dụng vitamin đều tăng cao hơn so với nghiệm thức đối chứng là 1,2. - Tuy nhiên, sự khác biệt thống kê so với đối chứng chỉ thể hiện ở nghiệm thức bổ sung 500 và 1000mg Vitamin C/kg. - (1985) cho thấy tổng bạch cầu của cá tăng cao và số lượng đại thực bào gia tăng có ý nghĩa thống kê khi bổ sung vitamin C với hàm lượng 3000 mg/kg thức ăn. - (2007), cá trê ăn thức ăn chứa vitamin C cho số lượng tổng bạch cầu gia tăng so với không bổ sung vitamin C. - Nghiên cứu bổ sung vitamin C và 1500 mg/kg thức ăn) cho cá trôi Ấn Độ (Labeo rohita) trong 2 tháng cho kết quả cá tăng trưởng nhanh, tổng bạch cầu và các loại bạch cầu đều gia tăng, đặc biệt tăng cao ở nghiệm thức bổ sung 1000 mg vitamin C/kg thức ăn (Arup et al., 2008).. - Bảng 1: Số lượng tổng bạch cầu sau 2 và 4 tuần bổ sung vitamin C. - Nghiệm thức 2 tuần (x 10 4 tế bào/ mm 3 ) 4 tuần (x 10 4 tế bào/ mm 3. - 0mg vitamin C/kg thức ăn 7,3 ± 2,1 a 7,8 ± 4,6 a. - 50mg vitamin C/kg thức ăn 6,9 ± 3,7 a 9,2 ± 3,5 a. - 500mg vitamin C/kg thức ăn b b. - 1000mg vitamin C/kg thức ăn 13 ± 3,2 b b. - Tế bào lympho: Kết quả định lượng tổng tế bào lympho sau 2 tuần cho thấy có sự gia tăng khác biệt giữa những nghiệm thức có bổ sung vitamin C với nghiệm không bổ sung vitamin C ngoại trừ nghiệm thức 50 mg/kg. - Sau 4 tuần bổ sung vitamin C, số lượng tế bào lympho tăng cao so với 2 tuần cho ăn Vitamin C trong cùng nghiệm thức. - Số lượng tế bào lympho ở các nghiệm thức và 1000 mg vitamin C/kg thức ăn đạt tương ứng 5,9. - 10.6 và 12.4 x 10 4 tế bào/ mm 3 . - Hầu hết các nghiệm thức cho ăn vitamin C đều cho thấy số lượng tế bào lympho tăng cao có ý nghĩa thống kê (p<0.05) so với nghiệm thức đối chứng lần lượt là 1,3. - Tế bào đơn nhân: Sau 2 tuần bổ sung vitamin C thông qua phương pháp cho ăn, số lượng tế bào đơn nhân tăng cao ở các nghiệm thức có bổ sung. - vitamin C so với nghiệm thức đối chứng (Hình 3), tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. - Sau 4 tuần cho ăn vitamin C, tế bào đơn nhân tiếp tục tăng cao. - Trong đó, nghiệm thức 500 và 1000 mg/kg tăng cao gấp 3 lần và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p<0.05). - Bổ sung vitamin C liều cao nhằm tăng cường sức đề kháng cho cá thông qua việc kích thích một số yếu tố miễn dịch không đặc hiệu đã được nghiên cứu trên nhiều loài cá (Lall et al, 1993. - Ở sinh vật, tế bào đơn nhân là tế bào tiền thân của đại thực bào. - Do vậy, gia tăng tế bào đơn nhân cũng là một cách gián tiếp làm tăng cường hoạt động đại thực bào trên cá nuôi.. - Hình 3: Số lượng tế bào đơn nhân của cá sau 2 và 4 tuần bổ sung Vitamin C. - Tế bào trung tính: Số lượng tế bào trung tính của các nghiệm thức có bổ sung vitamin C gia tăng so với nghiệm thức đối chứng sau 2 và 4 tuần bổ sung vitamin C, ngoại trừ nghiệm thức 50 mg/kg.. - Trong đó, nghiệm thức 1000 mg/kg có số lượng tế bào trung tính tăng gấp 3 lần (6.1 x 10 3 tế bào/mm 3 ) so với đối chứng (1.8 x 10 3 tế bào/mm 3 ) sau 4 tuần bổ sung vitamin C.. - Tiểu cầu: Kết quả định lượng tế bào tiểu cầu cho thấy sau 2 và 4 tuần bổ sung vitamin C, không có sự khác biệt thống kê về số lượng tiểu cầu giữa các nghiệm thức có và không có bổ sung vitamin C (p>0.05).. - 3.2 Hoạt tính lysozyme. - Kết quả hoạt tính lysozyme cho thấy có sự gia tăng sau 2 tuần bổ sung vitamin C, tuy nhiên nghiệm thức 50 mg/kg không có sự khác biệt so. - với nghiệm thức đối chứng. - Sau 4 tuần bổ sung vitamin C, tất cả nghiệm thức bổ sung vitamin C đều cho thấy hoạt tính lysozyme tăng rất cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng (Hình 4). - Shiau (2005) khi bổ sung vitamin C cho cá Epinephelus malabaricus. - Kết quả cho thấy hoạt tính lysozyme và bổ thể của cá tăng cao sau 21 ngày bổ sung 400 và 800 mg vitamin C/kg thức ăn. - Tương tự, bổ sung 500 mg vitamin C/kg thức ăn cho cá rô phi trong 1 tháng cũng làm gia tăng tốc độ tăng trưởng, tăng chỉ số tế bào máu, hoạt tính lysozyme và một số yếu tố miễn dịch không đặc hiệu khác (Ibrahem et al., 2010).. - (2012) đã báo cáo bổ sung vitamin C cho Rachycentron canadum cũng làm tăng tỉ lệ tăng trưởng, tăng số lượng tế bào bạch cầu và hoạt tính lysozyme.. - Hình 4: Hoạt tính lysozyme của cá sau 2 và 4 tuần bổ sung Vitamin C 3.3 Hoạt tính bổ thể. - Sau 2 tuần bổ sung vitamin C, hoạt tính bổ thể ở các nghiệm thức không có sự khác biệt thống kê (Hình 5). - Tuy nhiên, sau 4 tuần bổ sung vitamin C, hoạt tính bổ thể lần lượt tăng cao tỉ lệ thuận với liều lượng bổ sung vitamin C và thể hiện sự khác. - biệt thống kê với nghiệm thức đối chứng (p<0.05), ngoại trừ nghiệm thức có hàm lượng vitamin C thấp (50 mg/kg). - (2001), bổ sung 3 g vitamin C/kg thức ăn cho cá Sparus aurata trong 45 ngày làm gia tăng tỉ lệ tăng trưởng, hoạt tính bổ thể và khả năng thực bào của cá nuôi.. - Hình 5: Hoạt tính bổ thể của cá sau 2 và 4 tuần bổ sung Vitamin C. - 3.4 Kết quả cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila. - bình thường và không chết, trong khi đó ở các nghiệm thức cá được tiêm vi khuẩn đều xuất hiện dấu hiệu bệnh lý tương ứng với từng loại vi khuẩn và có xuất hiện cá chết trong suốt 7 ngày đầu của quá trình theo dõi.. - Hình 6: Tỉ lệ chết của cá sau cảm nhiễm với vi khuẩn Khi cảm nhiễm với vi khuẩn A. - nghiệm thức đối chứng cho tỉ lệ chết là 60% cao hơn so với các nghiệm thức có bổ sung vitamin C.. - Tỉ lệ chết giảm dần ở các nghiệm thức có bổ sung vitamin C lần lượt là 50%, 33% và 20% tương ứng với nghiệm thức 50 mg, 500 mg và 1000 mg vitamin C/kg thức ăn.. - Tương tự, cá cảm nhiễm với vi khuẩn E.. - ictaluri cũng có tỉ lệ chết cao nhất ở nghiệm thức đối chứng (57. - Các nghiệm thức bổ sung vitamin C có tỉ lệ chết thấp hơn (53%, 20% và 17%) tương ứng với các nghiệm thức 50, 500 và 1000 mg vitamin C/kg thức ăn (Hình 6).. - Kết quả tái dịnh danh vi khuẩn sau cảm nhiễm cho thấy tác nhân gây chết cá trong từng thí nghiệm cảm nhiễm tương ứng với vi khuẩn đã sử dụng để cảm nhiễm.. - Sau 4 tuần bổ sung vitamin C thông qua phương pháp cho ăn, số lượng hồng cầu của cá tăng nhẹ nhưng không khác biệt với nghiệm thức đối chứng. - Có sự gia tăng rõ rệt số lượng tế bào máu bao gồm tổng bạch cầu và các loại tế bào bạch cầu như tế bào lympho, tế bào đơn nhân và bạch cầu trung tính ở nhóm cá được bổ sung vitamin C trong 4 tuần. - Bên cạnh đó, hoạt tính lysozyme và bổ thể cũng gia tăng tỉ lệ thuận với hàm lượng vitamin C bổ sung. - Trong đó, nghiệm thức bổ sung 500 và 1000 mg vitamin C/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất. - Kết quả cảm nhiễm với vi khuẩn cho thấy. - bổ sung vitamin C vào thức ăn có khả năng làm giảm tỉ lệ chết của cá.. - Phát hiện vi khuẩn. - Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chẩn đoán vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên thận cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) bệnh xuất huyết. - Tìm hiểu sự biến động của các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri