- BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN HỮU ÍCH TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) THÂM CANH. - Tổng vi khuẩn, Vibrio và một số nhóm vi khuẩn hữu ích đã được xác định trong ao nuôi tôm thâm canh tại tỉnh Sóc Trăng. - Kết quả cho thấy mật độ tổng vi khuẩn trong bùn dao động từ 5,3x10 4 CFU/g đến 1,2x10 6 CFU/g nhưng mật độ trong nước ít hơn rất nhiều, từ 2,9x10 2 đến 3x10 4 CFU/mL. - Nhóm Bacillus có khuynh hướng ổn định trong suốt quá trình thu mẫu và dao động từ 4,3x10 4 đến 7,9x10 5 CFU/g, chiếm trung bình 87,9% so với tổng vi khuẩn. - Trong khi đó mật độ nhóm Nitrosomonas dao động từ 7 tế bào/g đến 2,6x10 3 tế bào/g và chiếm trung bình 40,7% so với tổng vi khuẩn.. - Nitrobacter chỉ thấy từ đợt thu mẫu thứ 4 và có mật độ thấp nhất từ 5,5 đến 1,9x10 3 tế bào/g bùn, chiếm 28,3% so với tổng vi khuẩn. - Ngoài ra, mật độ Vibrio có khuynh hướng tăng dần trong suốt thời gian nuôi.. - Quản lý môi trường ao nuôi tôm thâm canh bằng các biện pháp sinh học ngày càng được áp dụng rộng rãi. - Giải pháp này vừa có ý nghĩa quản lý hữu hiệu môi trường. - trong ao nuôi đồng thời hạn chế thải nước bẩn ra môi trường có thể gây tác động xấu đến môi trường. - Các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu những lợi ích của các vi sinh vật hữu ích thông qua cơ chế tác động của chúng như sản xuất các hợp chất ức chế vi sinh vật gây hại, cạnh tranh về dinh dưỡng và nơi cư trú, tiết enzym phân hủy hợp chất hữu cơ giúp cải thiện môi trường ao nuôi, hỗ trợ quá trình tiêu hóa cho đối tượng nuôi… Một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất là Bacillus. - Bacillus được biết là vi khuẩn tiết ra enzyme phân hủy các chất bột đường, chất béo và chất đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. - Theo (Moriarty 1996 và 1998), Bacillus tiết ra nhiều enzyme ngoại bào, những vi khuẩn này đã được sử dụng rộng rãi như vi sinh vật hữu ích.. - Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khi bổ sung vi khuẩn này vào môi trường nuôi tôm sú thì tỉ lệ sống của tôm được cải thiện đáng kể và hệ miễn dịch tăng lên rõ rệt (Rengripat et al . - Vaseeharan 2003 chứng minh được hiệu quả ức chế sự phát triển của vi khuẩn phát sáng Vibrio harveyi của Bacillus subtilis trong môi trường nuôi tôm sú, làm giảm tỉ lệ hao hụt được 90%.. - Ngoài ra, còn nhóm vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa đạm trong chu trình nitơ là nhóm vi khuẩn nitrate hóa, chúng có khả năng chuyển NH 3 , NO 2 - thành NO 3. - Các vấn đề này được giải quyết nhờ vào nhóm vi khuẩn Nitrosomonas có khả năng oxy hóa NH 3 thành NO 2 - rồi sau đó NO 2 - tiếp tục được oxy hóa thành NO 3 - (có lợi cho môi trường và thủy sinh vật) nhờ nhóm vi khuẩn Nitrobacter.. - Hiện nay rất ít nghiên cứu về sự có mặt và sự biến động cũng như thành phần và số lượng của vi khuẩn nitrate trong ao nuôi tôm sú thâm canh. - Vì vậy, đề tài này được thực hiện nhằm mục đích xác định sự biến động các nhóm vi khuẩn nói trên trong ao nuôi tôm sú thâm canh từ đó đánh giá khả năng cải thiện chất lượng nước thông qua các thông số môi trường.. - Mật độ tôm thả nuôi 30 tôm bột/m 2 và diện tích ao 1. - 2.3 Phương pháp xác định mật độ. - Mật độ vi khuẩn được xác định theo phương pháp của (Huys, 2002).. - 2.3.1 Xác định mật độ tổng vi khuẩn và Vibrio. - Chuẩn bị môi trường TSA (Tripticase Soya Agar. - và TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar) để cấy vi khuẩn.. - Sau đó lấy từ mỗi mẫu này 3 mL dạng dung dịch huyền phù vi khuẩn tại phần giữa của ống nghiệm chuyển sang một ống nghiệm rỗng đã tiệt trùng rồi trộn với nhau thành 1 mẫu 9 mL đại diện cho ao đó, được độ pha loãng 10 -1 . - Tiếp tục pha loãng mẫu đến khoảng 10 -6 tuỳ thuộc vào mật độ vi khuẩn trong bùn đáy ao theo cách sau: lắc đều mẫu 10 -1 trong 1 phút rồi để yên cho lắng 30 giây và chuyển 1 mL dung dịch ở phần giữa ống nghiệm sang ống nghiệm khác chứa 9 mL nước muối sinh lý được độ pha loãng 10 -2 . - Sau đó chọn 3 độ pha loãng thích hợp cho mật độ của vi khuẩn tổng cộng và vi khuẩn Vibrio hiện diện trong các ao, rồi hút 100 μl từ mỗi nồng độ pha loãng của mẫu bùn trong mỗi ao cho vào các đĩa môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl) và TCBS, dùng que thủy tinh trãi đều. - Ủ các đĩa môi trường ở 30 o C trong 24–28 giờ. - Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động trong khoảng từ 20 đến 200 khuẩn lạc và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/g bùn. - đĩa môi trường và tính số lượng trung bình cùng độ lệch chuẩn. - Số lượng vi khuẩn được tính bằng công thức:. - Mật số vi khuẩn (CFU/g bùn. - số khuẩn lạc × độ pha loãng Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus, Nitrosomonas và Nitrobacter. - a) Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus:. - Dùng micropipete hút 100 µL dung dịch huyền phù vi khuẩn cho vào các đĩa chứa môi trường chuyên biệt cho giống Bacillus và dùng que thủy tinh tán đều đến khi mẫu khô. - Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp số khả hữu (MPN) (Pickering, 1975).. - Chuẩn bị môi trường ammonium-calcium-carbonate cho MPN của nhóm vi khuẩn oxi hóa ammonium (Nitrosomonas): (NH 4 ) 2 SO 4 (0,5g). - Lấy 5mL môi trường này cho vào ống nghiệm để nuôi vi khuẩn, đem tiệt trùng ở 121 0 C trong 20 phút.. - Chuẩn bị môi trường nitrite-calcium-carbonate cho MPN nhóm vi khuẩn oxi hóa nitrite (Nitrobacter) KNO 2 (0,006g). - Lấy 5 mL môi trường này cho vào các ống nghiệm để nuôi vi khuẩn, tiệt trùng ở 121 o C trong 20 phút.. - Pha loãng mẫu bùn. - Tiếp tục đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp cho mật độ vi khuẩn trong mẫu.. - Mỗi ao chuẩn bị 9 ống nghiệm chứa môi trường amonium-calcium-carbonate và 9 ống nghiệm chứa môi trường nitrite-calcium-carbonate, chuyển 1 mL dung dịch huyền phù vi khuẩn ở 3 độ pha loãng thích hợp cho vào các ống nghiệm chứa môi trường trên, mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần. - Mỗi môi trường lấy 3 ống nghiệm, các ống nghiệm này chỉ chứa môi trường nuôi không cho dung dịch vi khuẩn vào để làm đối chứng âm. - Các ống nghiệm chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn và các ống đối chứng âm này được ủ ở 28 o C khoảng 21 ngày.. - Sau khi ủ, kiểm tra sự có mặt của NO 2 - ở các ống nghiệm chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn và các ống đối chứng âm bằng thuốc thử Griess-Ilosway. - Trộn lẫn các phần đều nhau của thuốc thử dung dịch A, B và C, sau đó thêm vài giọt dung dịch huyền phù vi khuẩn từ mỗi ống. - Xác định dương tính đối với nhóm AOB (ammonia oxidizing bacteria) vi khuẩn oxy hóa amonia: tất cả các ống chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn của môi trường amonium-calcium-carbonate xuất hiện màu đỏ hồng trong 5 phút khi có mặt NO 2. - Xác định dương tính đối với nhóm NOB: tất cả các ống nghiệm chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn của môi trường nitrite-calcium-carbonate không xuất hiện màu đỏ hồng sau khi phản ứng với thuốc thử Griess-Ilosway chứng tỏ không còn NO 2. - Nếu các ống đối chứng âm cho kết quả dương tính sau khi nhỏ thuốc thử chứng tỏ môi trường đã bị nhiễm.. - Xác định số lượng ống nghiệm chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn cho phản ứng dương tính: kiểm tra 3 độ pha loãng, kết quả từ 3 lần lập lại của mỗi độ pha loãng được sử dụng để xác định chỉ số MPN. - 3.1 Sự biến động mật độ vi khuẩn tổng và Vibrio trong nước và trong bùn 3.1.1 Biến động mật độ vi khuẩn tổng và Vibrio trong nước. - Kết quả khảo sát cho thấy mật độ vi khuẩn tổng trong nước tăng dần theo thời gian nuôi từ 2,46x10 3 đến 3x10 4 CFU/mL (Hình 1). - Mật độ và sự dao động của vi. - chất hữu cơ trong quá trình nuôi thâm canh là nguyên nhân làm tăng mật số vi khuẩn dị dưỡng trong ao. - Tuy nhiên, việc xử l ý vi sinh định kỳ 7 ngày/lần đã góp phần đáng kể vào sự gia tăng và ổn định mật độ vi khuẩn trong ao.. - Theo (Anderson 1993), trong môi trường nước sạch mật độ vi khuẩn tổng nhỏ hơn 10 3. - CFU/mL, nếu mật độ vi khuẩn vượt quá 10 7 CFU/mL sẽ có hại cho tôm cá nuôi và môi trường trở nên bẩn. - Như vậy kết quả về mật độ vi khuẩn khảo sát được vẫn còn nằm trong giới hạn cho phép, chứng tỏ môi trường nước ao sạch và không nhiễm bẩn.. - Tương tự như sự biến động mật độ vi khuẩn tổng, Vibrio trung bình ở các ao khảo sát có khuynh hướng tăng dần từ 26 CFU/mL đến 3,4x10 2 CFU/mL (Hình 3.1) trong 15 ngày đầu, nhưng sau đó biến động tăng giảm không ổn định, tuy nhiên mật độ cao nhất chỉ thấp hơn 10 3 CFU/mL. - Theo Moriaty (1999) mật độ an toàn Vibrio có hại, đặc biệt là vi khuẩn phát sáng vượt quá 10 3 thì gây tác hại đến tôm.. - Lý do mật độ Vibrio luôn thấp có thể do vai trò tiết chất kháng sinh của vi khuẩn Bacillus có mặt trong chế phẩm vi sinh đã được sử dụng định kỳ. - Sản phẩm các kháng sinh được tiết ra là dificiden và oxydifficidin có khả năng kháng các loài vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí (Zimmerman et al., 1987) và một số kháng sinh thông thường khác như:. - Mặt khác, mật độ Vibrio biến động lớn hơn vi khuẩn tổng. - Qua các đợt khảo sát cho thấy mật độ Vibrio tăng dần đến lần thu mẫu thứ 5 (ngày nuôi) sau đó giảm nhanh ở lần thu mẫu thứ 6 (ngày nuôi) nguyên nhân có thể trong quá trình nuôi các thuốc diệt tảo và nấm sau đã được sử dụng trong đợt thu mẫu thứ 5 (ngày nuôi) đã làm giảm mật độ Vibrio. - Tuy nhiên, sau đó mật độ Vibrio tiếp tục tăng ở lần thu thứ 7 (75 ngày nuôi) và giảm lần thu 8 (90 ngày nuôi) và cuối cùng tăng dần đến đợt thu thứ 10 (135 ngày nuôi). - 3.1.2 Biến động mật độ vi khuẩn tổng và Vibrio trong bùn. - Mật độ vi khuẩn tổng trong bùn đáy ao dao động từ 5,3x10 4 CFU/g đến 1,2x10 6 CFU/g (Hình 2). - Mật độ. - Hình 1: Tổng vi khuẩn và tổng Vibrio trong nước. - vi khuẩn tổng có khuynh hướng tăng dần theo thời gian nuôi. - So với sự biến động vi khuẩn trong nước thì biến động mật độ vi khuẩn trong bùn nhỏ hơn nhưng mật độ vi khuẩn trong 1g. - Nguyên nhân có thể trong bùn hàm lượng chất dinh dưỡng nhiều hơn, là môi trường thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng.. - Mật độ vi khuẩn Vibrio trong bùn đáy ao tăng liên tục (2,1x10 2 đến 1,5x10 5 CFU/g) và có khuynh hướng tăng dần. - Trong khi đó mật độ Vibrio trong nước dao động từ 26 tế bào đến 2,3x10 2 tế bào/mL trong nước và tăng giảm liên tục trong quá trình nuôi. - Sự biến động của Vibrio cũng tương tự như sự biến động của vi khuẩn tổng trong bùn đáy ao, vi khuẩn Vibrio trong bùn ít biến động hơn trong nước và có khuynh hướng tăng dần theo thời gian nuôi.. - 3.2 Biến động mật độ bào tử vi khuẩn Bacillus, Nitrosomonas (AOB) và Nitrobacter (NOB) trong bùn. - 3.2.1 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong bùn. - Mật độ Bacillus trong bùn đáy ao dao động trong khoảng từ 4,3x10 4 đến 7,9x10 5 CFU/g, chiếm trung bình 87,9% so với tổng vi khuẩn. - 3.2.2 Sự biến động mật độ vi khuẩn Nitrosomonas (AOB) và Nitrobacter (NOB). - Trong suốt vụ nuôi (gồm 10 đợt thu mẫu định kỳ tại 4 ao nuôi với 40 mẫu)(Hình 3) thì thấy mật độ trung bình của nhóm AOB và NOB trong bùn đáy ao lần lượt chiếm 40,7% và 28,3% so với vi khuẩn tổng cộng.. - Hình 2: Tổng vi khuẩn và Vibrio trong bùn. - Nhóm vi khuẩn nitrate hóa thường phân bố ở những nơi có nhiều hợp chất nitơ và muối vô cơ như nước thải công nghiệp, nước cống, đáy ao nhiều bùn vì vậy tại các khu vực đó mật độ của chúng có thể lên đến tế bào/g bùn (Rennie. - Những điều kiện môi trường này làm cho mật độ vi khuẩn nitrate hóa trong bùn thấp.. - Mật độ nhóm AOB qua 10 đợt thu mẫu nằm trong khoảng từ 7 tế bào/g đến 2,6x10 3 tế bào/g. - (1998) định lượng nhóm AOB trong mẫu bùn bằng kỹ thuật MPN, kết quả của tác giả xác định mật độ của chúng khoảng từ tế bào/g với pH đất từ 5–6. - Một nghiên cứu tương tự như vậy của (Hesslsoe et al., 2001) cho thấy mật độ AOB khoảng 1,79x10 3 tế bào/g.. - So với nhóm AOB thì mật độ của nhóm NOB thấp hơn rất nhiều, chỉ từ 5,5- 1,9x10 3 tế bào/g bùn và không có sự hiện diện của chúng trong các đợt 1,2,3. - Những báo cáo về mật độ nhóm NOB trong đất của một số tác giả như (Degrange và Bardin, 1995) đếm quần thể NOB từ đất bằng phương pháp PCR nằm trong khoảng hoặc 10 3 CFU/g. - Rennie và Schmid (1977) cho biết mật độ của chúng cao hơn từ CFU/g. - NOB trong bùn thấp là do hoạt động và sự phát triển của chúng dễ bị ức chế bởi các yếu tố môi trường như nồng độ NH 3 và pH cao. - Hình 3: Mật độ vi khuẩn suốt thời gian nuôi. - Mật độ vi khuẩn tăng lên qua các đợt thu mẫu, đặc biệt trong đợt 5 và 6 (45-60 ngày nuôi), có thể do nồng độ NH 4 + và NO 2 - ngày càng cao vì quá trình trao đổi chất của tôm tăng lên khi tôm lớn và sự tích luỹ thức ăn dư thừa ở đáy ao cũng tăng. - Bên cạnh đó, do men vi sinh được bón vào các ao nuôi định kỳ và chỉ sử dụng một loại men đã tạo điều kiện thuận lợi cho quần thể vi sinh vật hữu ích phát triển, cân bằng mật độ vi khuẩn tổng cộng trong ao. - Tổng vi khuẩn trong nước và trong bùn thích hợp cho nuôi tôm sú và dao động từ lần lượt 2,9x10 2 -3x10 4 CFU/mL và 5,3x10 4 CFU/g đến 1,2x10 6 CFU/g.. - Số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus trong bùn có khuynh hướng ổn định và chiếm ưu thế trong suốt quá trình nuôi và dao động trong khoảng từ 4,3x10 4 đến 7,9x10 5 CFU/g, chiếm trung bình 87,9% so với tổng vi khuẩn.. - Mật độ nhóm AOB trong bùn dao động từ 7 tế bào/g đến 2,6x10 3 tế bào/g và chiếm trung bình khoảng 40,7% so với tổng vi khuẩn.. - Nhóm NOB có mật độ thấp nhất từ 5,5 đến 1,9x10 3 tế bào/g bùn, chỉ chiếm khoảng 28,3% so với tổng vi khuẩn.. - Mật độ Vibrio dao động từ 2,1x10 2 đến 1,5x10 5 CFU/g trong bùn và từ 26 CFU/mL đến 2,3x10 2 CFU/mL trong nước và có khuynh hướng tăng dần trong quá trình nuôi.