- CÁC BIẾN THỂ GENE OsTZF1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở GIỐNG LÚA ĐỐC PHỤNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ BỘ GENE Huỳnh Kỳ 1. - Trong nghiên cứu này, kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (next generation sequencing) được ứng dụng để giải trình tự của bộ gene 2 giống lúa Đốc Phụng (giống chống chịu mặn) và giống Nếp Mỡ (giống mẫn cảm với mặn), nhằm tìm các chỉ thị phân tử là gene chức năng mà các gene này liên quan đến cơ chế chống chịu mặn có trong giống lúa Đốc Phụng. - Kết quả so sánh với bộ gene tham chiếu, bộ gene của giống lúa Đốc Phụng có khoảng 1.918.726 biến thể dạng thay đổi một nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism) và và chèn vào khoảng 81.435, mất đi khoảng 81.974. - Đa số các biến thể xuất hiện ở các vùng không mang chức năng như trước sau và giữa các gene chiếm tỉ lệ trên 75%. - Kết quả khảo sát biến thể xuất hiện trong vùng gene OsTZF1 (LOC_Os05g10670.1), có chức năng điều hòa các nhóm gene liên quan đến các yếu tố stress sinh học và phi sinh học, cho thấy ở giống Đốc Phụng có 7 biến thể SNP và có chèn thêm 9 nucleotide mã hóa 3 amino acid arginine khi so với giống Nếp Mỡ dựa trên bộ gene tham chiếu. - Islam et al., 2018) và có tính thương mại. - Nhằm đảm bảo an ninh lương thực, việc canh tác giống lúa trên nền đất bị nhiễm mặn và đảm bảo sản lượng là cần thiết.. - Khai thác và sử dụng nguồn gene lúa địa phương, ở những vùng bị xâm nhiễm mặn là một trong những chiến lược mà các nhà chọn tạo giống ưu tiên (Menguer et al., 2017. - Rahman et al., 2016), tuy nhiên chiến lược này đôi khi không thành công vì nguồn gene lúa có khả năng chống chịu mặn không mang lại năng suất, hoặc phụ thuộc rất nhiều vào thời vụ và thường thì chất lượng gạo không cao (Rahman et al., 2016). - Vì vậy, có rất nhiều báo cáo đã khai thác thông tin của bộ gene từ các giống lúa địa phương trong công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn (Lakra et al., 2019. - Subudhi et al., 2020. - Yuan et al., 2020). - Ngày nay với tiến bộ của khoa học công nghệ, kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing-NGS) đã phát triển mạnh mẽ giúp cho việc khai thác thông tin di truyền một cách nhanh chóng, hiệu quả và hỗ trợ cho công tác chọn tạo giống dựa trên nền tảng dấu chỉ thị phân tử (Barba et al., 2014). - Bằng việc sử dụng kỹ thuật NGS đã xây dựng bộ gene tham chiếu trên cây lúa một cách hoàn chỉnh và chính xác hơn (Kawahara et al., 2013), từ cở sở đó đã giúp cho cung cấp thông tin về các đa hình khi sử dụng bộ gene tham chiếu để so sánh các bộ gene cần nghiên cứu (Huang et al., 2013). - Thực vậy, việc phát hiện ra các biến thể trên toàn bộ bộ gene tạo cơ hội để làm sáng tỏ cơ sở phân tử của sự khác biệt kiểu hình, đặc biệt là các biến thể giúp cho cây trồng có khả năng chống chịu lại với các điều kiện bất lợi của môi trường. - Trên cơ sở đó, nghiên cứu này đã ứng dụng công nghệ NGS để giải mã bộ gene của 2 giống lúa địa phương vùng Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) 1 giống có khả năng chịu mặn và 1 giống mẫn cảm với mặn nhằm tìm ra các biến thể ở các gene mang tính chống chịu mặn. - đã được xác định từ các nghiên cứu trước (Jain et al., 2014. - Chen et al., 2017), từ đó có thể sử dụng chúng như các chỉ thị phân tử dùng cho chọn giống chống chịu mặn trong tương lai.. - Hai giống lúa địa phương có kiểu hình tương phản được dùng trong thí nghiệm này là Đốc Phụng (chống chịu mặn) và Nếp Mỡ (mẫn cảm mặn) được lấy từ ngân hàng giống của Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. - Hai giống lúa Đốc Phụng và Nếp Mỡ được lựa chọn cho nghiên cứu dựa trên kết quả từ nghiên cứu của Tam (2019) và Tin et al.. - DNA của 2 giống lúa dùng cho nghiên cứu được ly trích theo quy trình Doyle (1990), sau khi ly trích thành công, DNA được kiểm tra chất lượng bằng Nanodrop (Thermofisher, USA) và Bioanalyzer (Agilent, USA). - Phân tích bộ gene. - Sử dụng chương trình fastp V0.20.0 như một bộ tiền xử lý file FASTQ để kiểm tra chất lượng và các tính năng lọc dữ liệu, chương trình này chạy nhanh hơn 2-5 lần các so với các chương trình xử lý khác như Trimmomatic hay Cutadapt (Chen et al., 2018). - Những trình tự được đọc sau khi được kiểm tra chất lượng được gắn vào bộ gene tham chiếu Os-Nipponbare-Reference- IRGSP-1.0 (Kawahara et al., 2013) có trên Ensembl Plants website (Bolser et al., 2016) bằng cách sử dụng phần mềm HISAT2 V2.1.0 (Kim et al., 2015;. - Snelling, 2018), và loại bỏ hoàn toàn các low-mapping quality (MAPQ<30) bằng công cụ SAMtools toolkit V1.9 (Li et al., 2009). - Xác định biến thể (variant calling) Sau khi loại bỏ các lỗi do trùng lắp gây ra và sắp xếp lại các vùng xung quanh InDels , sau đó sử dụng. - chương trình SAMtools toolkit V1.9 (Li et al., 2009) và BCFtools V1.9 (Li, 2011) cho việc phát hiện biến thể SNPs, InDels. - Tiếp theo, loại bỏ các biến thể được dò tìm có chất lượng thấp (%QUAL<20), chỉ giữ lại các biến thể có chất lượng cho các phân tích sâu hơn bằng công cụ BCFtools V1.9 (Li, 2011).. - Ngoài ra, đối với các vị trí có độ nhiễu cao (low-complexity) sẽ được đánh dấu là DUST (Morgulis et al., 2006) chúng được loại bỏ bằng công cụ minimap toolkit V0.2 (https://github.com/lh3/minimap) (Li, 2016;. - Chu et al., 2017).. - Sử dụng chương trình IGV (integrative geneome viewer) truy cập tại trang web Integrative Geneome Viewer (https://www.igv.org) để kiểm tra và so sánh những biến thể đột biến chèn hoặc mất đoạn (InDels) giữa các mẫu so với bộ gene tham chiếu. - Nipponbare phiên bản 7.0 (Robinson et al., 2011;. - Thorvaldsdóttir et al., 2013) và so với các giống với nhau ở các vùng Quantitative Trait Locus (QTL) liên quan đến khả năng chống chịu mặn đã được Naveed et al. - Kết quả đọc và ghép vào bộ gene tham chiếu. - Kết quả giải trình tự bộ gene của 2 giống lúa thí nghiệm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới thông qua hệ thống Illumina HiSeq 2500™ thu được số lượng đọc sau khi loại bỏ các lần đọc có chất lượng thấp hơn 30% tương ứng là bp cho Đốc Phụng và bp cho Nếp Mỡ (Bảng 1). - 67% của 2 giống lúa.. - Số liệu của 3 giống lúa được giải trình tự Giống lúa Số liệu read thô. - Đốc Phụng . - Nếp Mỡ . - Qua phân tích kết biến thể di truyền gồm đột biến điểm thay đổi nucleotide (SNPs) và đột biến mất hay chèn nucleotide (InDels) giữa 2 giống lúa dựa trên bộ gene tham chiếu Nipponbare thu được tổng số SNP khoảng 1.918.726 và chèn vào khoảng 81.435, mất đi khoảng 81.974 ở giống Đốc Phụng. - Mật độ xuất hiện các loại biến thể trung. - Kết quả nghiên cứu này cũng tương ứng như kết quả tìm thấy khi so sánh bộ gene của hai giống lúa hoang của Trung Quốc với bộ gene tham chiếu Nipponbare và 93-11 (Liu et al., 2017), và cũng được tìm thấy khi nghiên cứu bộ gene của 1.143 dòng lúa lai có nguồn gốc từ các bố mẹ ưu tú ở Trung Quốc (Lv et al., 2020).. - Số liệu SNPs và InDels của 2 giống lúa. - Giống lúa SNP InDel. - Bên cạnh đó, số lượng biến thể SNPs và InDels của Nếp Mỡ chiếm cao hơn so với Đốc Phụng.. - Đa hình DNA trên 12 NST của ở các giống Đốc Phụng và Nếp Mỡ A. - Tỉ lệ Ts/Tv của Nếp Mỡ (2.617) cao hơn so với Đốc Phụng (2.593) (Hình 2B), tỉ lệ Ts/Tv được báo cáo trên lúa và ngô (Batley et al., 2003. - Subbaiyan et al., 2012). - Một trong những đặc điểm quan trọng của đột biến là vị trí của đa hình DNA vì được biết có ảnh hưởng đến sự biểu hiện và chức năng gene (Subbaiyan et al., 2012. - Subudhi et al., 2020). - quan trọng vì chúng có thể làm thay đổi chức năng của protein, các biến thể xuất hiện trong vùng enhancer có thể làm giảm hay kìm hãm sự biểu hiện gene. - Jain et al., 2014). - Tần suất của các đột biến di truyền xuất hiện nhiều ở các vùng không mã hóa có thể do chịu áp lực ít hơn từ chọn lọc tự nhiên (Barreiro et al., 2008). - Cụ thể, các đa hình DNA xuất hiện nhiều nhất trong vùng upstream và downstream chiếm tỉ lệ gần bằng và hơn 30%, tiếp đến là vùng intergeneic đạt hơn 21% và 16% lần lượt cho các biến thể SNPs và InDels, vùng intron đạt khoảngg 3,1-4,4%, trong khi đó vùng mã hóa chỉ chiếm tỉ lệ khoảngg 1,6-2,9%, cuối cùng gồm các vùng exon, 5′UTR và 3′UTR có tỉ lệ thấp nhất chỉ khoảngg Hình 3).. - Phân loại biến thể ở hai giống lúa Đốc Phụng và Nếp Mỡ A. - số lượng loại biến thể Ts và Tv. - Tỉ lệ biến thể Ts/Tv. - Các biến thể xảy ra bên ngoài vùng mã hóa cũng có khả năng tác động đến sự biểu hiện của gene như đột biến ở vùng promoter, các vị trí ghép nối các exon trong quá trình tổng hợp RNA thông tin trưởng thành (splice-site regions), hay các vị trí liên kết của các ribosome. - Tỉ lệ đột biến của 2 giống lúa được thể hiện trong Bảng 3, hầu hết tỉ lệ của đột biến sai nghĩa chiếm hơn 50% trong tổng số các dạng đột biến có mức ảnh hưởng đến chức năng, tuy nhiên tỉ lệ đột biến này ở giống Nếp Mỡ thấp hơn so với Đốc Phụng.. - Tỉ lệ SNP (A) và InDels (B) xuất hiện ở các vị trí trong bộ gene Bảng 3. - Tỉ lệ các loại đột biến xuất hiện trên 2 giống lúa thí nghiệm. - Tên giống Tỉ lệ đột biến. - Phân tích biến thể có trong các gene chịu mặn trên lúa. - Phần lớn các biến thể xuất hiện nhiều ở vùng intergeneic, promoter và ít hơn ở vùng mã hóa DNA (Fuentes et al., 2019). - Sự hiện diện của các biến thể ở vùng mã hóa exon được chú trọng hơn so với các vùng khác, mặc dù các biến thể trong vùng này. - không đủ để thiết lập bản đồ cho các đặc tính nông học phức tạp (Steri et al., 2018). - Biến thể SNP/InDel hiện diện trên vùng promoter hay sự liên kết giữa các biến thể vùng này và vùng mã hóa đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến các đặc điểm nông học trên cây trồng, tuy nhiên các hiểu biết về sự ảnh hưởng này vẫn chưa được hiểu rõ và chưa có nhiều báo cáo trên cây lúa (Wang et al., 2018. - Wang et al., A. - Ngoài ra, các biến thể di truyền tại vùng unstranlated region (UTR) có thể thay đổi các yếu tố điều hòa từ đó tác động đến quá trình phiên mã của mRNA (Steri et al., 2018). - Đáng chú ý hơn là có đến 3,7% biến thể xuất hiện ở vùng UTR theo các. - nghiên cứu liên quan đến Genome-wide association studies (GWAS) (Hindorff et al., 2009). - Nhìn chung, mức độ phiên mã của gene có thể bị ảnh hưởng bởi SNP và InDel (Kreimer et al., 2012).. - Biến thể SNP (A) và InDel mất đi 3 amino acid Arginine (R) (B) ở giống lúa Đốc Phụng so với Nếp Mỡ. - 12 NST đã được báo cáo trước đây (Naveed et al., 2018), từ đó so sánh sự khác nhau của biến thể trên cùng một gene của 2 giống lúa. - biến thể được phát hiện ở gene OsTZF1 (LOC_Os05g10670.1) mang chức năng điều hòa hậu phiên mã của nhóm gene phản ứng với stress sinh học và phi sinh học (stress với hạn, mặn cao) (Jan et al., 2013. - Seong et al., 2020). - Khảo sát trên NST số 5 tại vùng gene OsTZF1 (LOC_Os05g10670.1) của giống lúa Đốc Phụng cho thấy biến thể SNPs (Hình 4A) và InDels (Hình 4B) thể hiện sự khác biệt rõ ràng với giống Nếp Mỡ.. - Hình 4A cho thấy vùng gene này có sự hiện diện của đa hình ở Đốc Phụng là 16 vị trí (vùng exon: 7 vị trí) so với Nếp mỡ chỉ có 1 vị trí khi so sánh với bộ gene tham chiếu. - Ngoài ra, Đốc Phụng có biến thể InDels trong vùng mã hóa exon tại vị trí bp đã làm thay đổi chuỗi polypeptide bằng cách chèn thêm 3 amino acid arginine, trong khi đó không có ở giống Nếp Mỡ (Hình 4B). - Như vậy, biến thể ở gene này có thể liên quan đến việc điều hòa nhóm gene giúp cho giống Đốc Phụng chống chịu tốt với stress mặn, như những nghiên cứu trước (Jan et al., 2013. - Naveed et al., 2018;. - Kết quả nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng đột biến mất 3 amino acid arginine của gene OsTZF1 được xem như là dấu chỉ thị phân tử là gene chức năng liên quan đến khả năng chống chịu mặn ở giống lúa Đốc Phụng nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa chống chịu mặn trong tương lai.. - Tóm lại, nghiên cứu này cho thấy phương pháp tiếp cận gene chức năng dựa trên cơ sở giải trình tự bộ gene là một trong những kỹ thuật hiệu quả nhất để xác định các gene chứa các biến thể SNP và InDel liên quan đến các đặc điểm mong muốn. - Việc phân tích biến thể xuất hiện ở giống lúa chịu mặn Đốc Phụng ở gene mục tiêu OsTZF1 là gene ứng viên cho điều hòa hoạt động các gene liện quan đến đặc tính chống chịu stress mặn là hợp lý. - Barba, M., Czosnek, H., &. - B., Laval, G., Quach, H., Patin, E., &. - M., Pritchard, E., &. - Chen, R., Cheng, Y., Han, S., Van Handel, B., Dong, L., Li, X., &. - Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., &. - L., Yang, C., &. - L., Tatarinova, T., Grigoriev, A., Mauleon, R., &. - Huang, X., Lu, T., &. - Kim, D., Langmead, B., &. - Tuyển chọn giống lúa cao sản chịu mặn cho vùng lúa – tôm tại tỉnh Bạc Liêu. - J., Shah-E-Alam, M., de Ocampo, M., Egdane, J., &. - S., Getz, G., &. - R., Vaddadi, S., &. - K., Shankar, R., &. - L., McCouch, S., &. - Wang, P., Xiong, Y., Gong, R., Yang, Y., Fan, K., &