- CÁC TÍNH CHẤT CƠ BẢN CỦA POLYPHENOL OXYDASE TRÍCH LY TỪ CỦ KHOAI LANG TRẮNG (IPOMOEA BATATAS L.). - Độ bền nhiệt, hoạt tính, khoai lang trắng, nhiệt độ,. - Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định các tính chất cơ bản của enzyme polyphenol oxydase (PPO) có trong khoai lang trắng (Ipomoea batatas L. - Kết quả khảo sát cho thấy, PPO có hoạt tính cao nhất ở 30 o C tương ứng với giá trị pH bằng 8,0. - Hoạt tính PPO ban đầu đạt 256,92 U/g (tính trên thành phần chất khô của nguyên liệu). - Kết quả khảo sát đã khẳng định PPO từ khoai lang trắng thuộc nhóm enzyme bền nhiệt. - Hoạt tính PPO được duy trì ở 4 o C, enzyme giảm gần 80% hoạt tính ban đầu ở 80 o C. - Khoai lang cũng. - Hoạt tính của enzyme nói chung, PPO nói riêng chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: nồng độ cơ chất, nồng độ. - enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,… Trên cơ sở đó, mục tiêu của nghiên cứu này là xác định các tính chất cơ bản của enzyme polyphenol oxydase được trích ly từ củ khoai lang trắng.. - Khoai lang trắng được thu nhận từ huyện Bình Tân (Vĩnh Long), bao gói bằng bao bì PE và bảo quản ở nhiệt độ thường (30 ± 2ºC), sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm, thời gian vận chuyển tối đa 1 ÷ 1,5 giờ.. - 2.2 Phương pháp chuẩn bị dịch trích PPO thô từ khoai lang trắng. - Khoai lang xử lý trong dung dịch sodium sulfite (10 g/L) với tỷ lệ mẫu: dịch ngâm là 1: 2 giữ lạnh trong thời gian 20 phút, sau đó vớt ráo và rửa lại bằng nước cất. - 2.3 Xác định hoạt tính của PPO. - Hoạt tính của PPO (U/g) được xác định dựa vào phương pháp Ensimiger và Vamos–Vigyazo (1995, trích dẫn bởi Chikezie, 2006). - Hoạt tính PPO tỷ lệ thuận với cường độ hấp thu cực đại của benzoquinones.. - Hoạt tính của PPO được tính dựa trên thành phần chất khô của khoai lang, theo công thức:. - Với a: hoạt tính của PPO trong 1 mL dịch trích (U/mL). - với khối lượng khoai lang tươi (m, g), X là độ ẩm của khoai lang trong mẫu khảo sát. - Để so sánh sự thay đổi hoạt tính PPO ở các điều kiện khảo sát khác nhau, khái niệm hoạt tính tương đối được sử dụng (Manohan và Wai (2012). - Theo Manohan và Wai (2012), giá trị hoạt tính PPO cao nhất trong chuỗi khảo sát là 100%, hoạt tính tương đối là tỷ số. - giữa hoạt tính PPO của mẫu khảo sát với hoạt tính PPO tại giá trị pH (hay nhiệt độ) tối ưu trong cùng một thí nghiệm.. - 2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.4.1 Xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO từ khoai lang trắng. - 2.4.2 Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO. - Dịch trích enzyme ủ ở các mức nhiệt độ từ 25 ÷ 55ºC trong 10 phút. - Dựa trên kết quả thống kê sự thay đổi hoạt độ PPO (thể hiện ở hoạt tính tương đối), xác định nhiệt độ tối thích cho hoạt động PPO tối ưu.. - 2.4.3 Độ bền nhiệt của enzyme PPO từ khoai lang trắng. - Dịch trích enzyme ủ ở các mức nhiệt độ từ 25 ÷ 55ºC trong 60 phút. - Dựa trên kết quả thống kê sự thay đổi hoạt độ PPO (hoạt tính tương đối), xác định độ bền nhiệt cho hoạt động của PPO.. - 2.4.4 Xác định vận tốc phản ứng cực đại, hằng số tốc độ phản ứng và hoạt tính enzyme PPO ban đầu. - hằng số tốc độ phản ứng (K m ) của PPO từ khoai lang trắng được xác định bằng cách cho phản ứng enzyme với cơ chất catechol ở các nồng độ từ 0,01 đến 0,1 M ở điều kiện nhiệt độ và pH tối thích đã được khảo sát ở mục 2.4.1 và 2.4.2. - Sử dụng phương trình Lineweaver – Burk từ các giá trị nghịch đảo 1/[S] và 1/V để xác định V max , K m cũng như hoạt tính ban đầu của PPO.. - 2.4.5 Ảnh hưởng của các phụ gia khác nhau đến hoạt tính của enzyme PPO. - Tiến hành xác định hoạt tính enzyme. - Xác định tỷ lệ hoạt tính PPO còn lại sau quá trình xử lý, so sánh với mẫu PPO đối chứng (không xử lý).. - 3.1 Giá trị pH tối thích cho hoạt động của PPO trích ly từ khoai lang trắng. - Thông số pH là giá trị quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của PPO. - Nhìn chung, hoạt tính PPO thay đổi ở các điều kiện pH khác nhau. - Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu quả hoạt động của PPO trong khoai lang trắng cho thấy, hoạt tính PPO thể hiện cao nhất ở pH 8. - Tến hành so sánh sự thay đổi hoạt tính PPO ở các điều kiện pH phản ứng khác nhau, so sánh với hoạt tính PPO ở pH 8, kết quả được thể hiện ở Hình 1.. - Hình 1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt động PPO trích ly từ khoai lang trắng Qua Hình 1 cho thấy, hoạt tính tương đối PPO. - trong khoai lang trắng có xu hướng tăng từ trong khoảng pH từ 6,0 ÷ 8,0 và đạt giá trị cao nhất ở bằng 8,0 và sau đó giảm chậm dần khi giá trị pH tăng đến 10,0. - Hoạt tính tương đối đạt giá trị thấp nhất ở pH bằng 6,0 trong các khoảng pH khảo sát.. - Ở các giá trị pH kiềm hoạt tính enzyme đạt trên 80% so với pH tối ưu. - Ngoài ra, pH còn ảnh hưởng đến sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải protein (coenzyme) của enzyme, vì thế làm giảm hoạt tính. - Kết quả thu được phù hợp với các khảo sát trước đó về pH tối ưu cho hoạt động của PPO. - 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của PPO từ khoai lang trắng. - Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính PPO từ dịch trích enzyme của khoai lang trắng cho thấy, hoạt tính PPO thu được ở nhiệt độ 30C đạt cao nhất (100. - tỷ lệ thay đổi hoạt tính PPO do tác động của nhiệt độ phản ứng (so sánh với điều kiện xử lý nhiệt 30C) được trình bày ở Hình 2.. - Kết quả thực nghiệm ở Hình 2 cho thấy, khi nhiệt độ thấp hơn hay cao hơn so với nhiệt độ tối ưu (30C) sẽ làm giảm hoạt tính enzyme (Mathewson, 1998). - Điều đó đúng với thực tế khi tăng nhiệt độ lên 35ºC thì hoạt tính chỉ còn 85%. - Khi tăng nhiệt độ xử lý PPO lớn hơn 35ºC thì hoạt tính chỉ còn khoảng từ . - Nhiệt độ môi trường phản ứng tăng, không chỉ làm tăng tốc độ phản ứng mà còn thúc đẩy quá trình biến tính protein, các. - Ở nhiệt độ thấp hơn (25ºC), các thành phần cấu tạo PPO có ít năng lượng để di chuyển, do đó tốc độ phản ứng chậm hơn, hoạt tính của enzyme PPO chỉ đạt 67,97%.. - Hình 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính tương đối của PPO trích ly từ khoai lang trắng. - Nhiệt độ tối ưu của PPO trên một số loại thực vật khác cũng được nghiên cứu, kết quả nghiên cứu cho thấy, phần lớn các enzyme PPO trích ly có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 30°C đến 40°C (Martinez và Whitaker, 1995). - Nghiên cứu gần đây của Lim (2011) nhiệt độ tối ưu cho enzyme PPO trên lá khoai lang là 45°C. - Nhiệt độ tối ưu PPO ở các loại củ khác nhau như sắn, khoai môn và khoai lang có nhiệt độ tối ưu là 30°C (Marshall et al., 2000), nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PPO từ một số loại quả, điển hình như táo, chuối và xoài có nhiệt độ tối ưu cũng được xác định ở 30°C.. - Khác hơn củ và một số quả, hoạt động của PPO từ hạt ca cao và hướng dương (Lee et al., 1991) có nhiệt độ tối ưu ở 45°C ở các điều kiện khảo sát.. - Kết quả khảo sát cũng cho thấy, với nhiệt độ tối thích 30°C gần như cân bằng với nhiệt độ môi trường bên ngoài ở Việt Nam, đồng thời khi xử lý nhiệt đến 55°C, hoạt tính của PPO từ khoai lang trắng vẫn duy trì ở mức cao (gần 80% hoạt tính PPO vẫn được duy trì). - Điều này cho thấy, khoai lang trắng chính là đối tượng cho hoạt động hóa nâu do tác động của PPO.. - 3.3 Xác định độ bền nhiệt của PPO thu nhận từ khoai lang trắng. - Tiến hành đánh giá độ bền nhiệt của PPO từ khoai lang trắng bằng cách ủ PPO ở các khoảng nhiệt độ khác trong thời gian 60 phút. - Sự thay đổi hoạt tính của PPO khi so sánh với hoạt tính PPO ở nhiệt độ tối ưu (trường hợp khảo sát là 30ºC) được thể hiện ở Hình 3. - Hoạt tính của PPO trong dịch trích enzyme từ khoai lang trắng giảm khi nhiệt độ tăng từ 30ºC đến 80ºC trong thời gian xử lý là 60 phút. - Khi tăng nhiệt độ đến 80ºC, hoạt tính PPO còn lại 21,86% so với khi xử lý ở nhiệt độ phòng.. - Đặc biệt, điều kiện nhiệt độ thấp (4ºC) là điều kiện thích hợp giúp duy trì hoạt động của PPO, hoạt tính PPO trong dịch trích được trữ ở 4ºC trong 1 giờ cao hơn (103,31%) cả ở chế độ nhiệt tối ưu cho hoạt động của PPO (30ºC). - Kết quả khảo sát trên cũng xác định rằng enzyme PPO trong khoai lang trắng là tương đối bền với nhiệt. - PPO hoạt động phụ thuộc vào nhiệt độ và cơ chất được sử dụng. - Hình 3: Khả năng bất hoạt bởi nhiệt của polyphenol oxidase từ củ khoai lang trắng 3.4 Xác định các thông số động học K m và. - V max của PPO trích ly từ khoai lang. - Bảng 1: Sự thay đổi mật độ quang A theo thời gian ủ của dịch trích PPO thô từ khoai lang trắng tương ứng với các nồng độ catechol khảo sát. - Hình 4: Đồ thị xác định các thông số động học V max , K m của PPO trong củ khoai lang trắng Qua kết quả phân tích, các thông số động. - học của PPO được xác định với hằng số K m là M và V max có giá trị tương ứng là 7,55.10. - Đồng thời, hoạt tính PPO tương ứng trong 0,1 mL dịch trích được tính:. - Với thể tích dịch trích V thu được là 54,5 mL, tương ứng với khối lượng mẫu ban đầu là 25,5 g và độ ẩm trung bình của khoai lang là 64,47%. - Do đó, hoạt tính PPO thô trong khoai lang ban đầu đạt 256,92 (U/g chất khô nguyên liệu).. - Nghiên cứu Manohan và Wai (2012) không xác định tổng lượng PPO có trong khoai lang mà chỉ khảo sát hoạt tính PPO trong 0,1 mL thể tích dịch trích, cho thấy giá trị PPO đo được là 3720 EU/phút/mL. - Đồng thời giá trị K m của khoai lang ở điều kiện khảo sát là 27,4 mM cao hơn nhiều lần so với giá trị K m theo nghiên cứu của Manohan và Wai (2012) là 3,57 mM. - Ngoài ra, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố nhiệt độ và pH cũng như tác động của các thành phần đóng vai trò là chất hoạt hóa và ức chế lên hoạt động của khoai lang trắng. - Các giá trị của K m của PPO từ artisô (10,2 mM), lá trà (12,5 mM), hạt đậu tương (10,5 mM), táo (34 mM), cải bắp (682,5 mM). - 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ các phụ gia đến hoạt tính của PPO. - Hoạt tính PPO giảm chỉ còn 25,86. - Hình 5: Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của PPO từ khoai lang trắng Hoạt tính enzyme PPO trong khoai lang sau. - Hoạt tính enzyme đạt 38,54% ở nồng độ 0,2 mM. - trong khi đó khi sử dụng 1,0 mM ascorbic hoạt tính còn lại chỉ là 16,37%. - Dựa trên kết quả thu được ở đồ thị hình 5b nhận thấy, hiệu quả ức chế của PPO có giá trị tới hạn, ứng với hai mức nồng độ acid ascorbic là 0,8 mM và 1 mM, hoạt tính PPO còn lại không có sự khác biệt.. - Hiệu quả ức chế thấp nhất khi xử lý với nồng độ 25 mM với hoạt tính enzyme còn lại đạt 74,90% so với ban đầu (không xử lý). - Từ kết quả Hình 5d chứng minh rằng, cũng như các loại phụ gia khác, acid citric cũng có tác dụng chống hóa nâu trên khoai lang. - So sánh hiệu quả ức chế hoạt động của PPO ở các mức nồng độ tối ưu của các chất ức chế sử dụng, kết quả thể hiện ở Bảng 2.. - Bảng 2: Ảnh hưởng của phụ gia đến khả năng ức chế enzyme PPO trong khoai lang. - (25 mM) Acid ascorbic (1,0 mM) Hoạt tính bị ức chế. - Tuy nhiên, khả năng ức chế của acid citric và sodium chloride là thấp ở nồng độ cao nhưng khả năng ức chế chỉ đạt khoảng 50% so với hoạt tính ban đầu.. - Nghiên cứu xác định được một số tính chất cơ bản của PPO thu được từ khoai lang trắng. - Trong đó, hoạt tính của enzyme thô ban đầu là 256,92 (U/g chất khô ) khi sử dụng catechol như là cơ chất.. - Nhiệt độ và pH tối thích cho hoạt động của PPO từ khoai lang trắng là 30ºC và pH = 8,0. - Hoạt tính PPO được duy trì ổn định ở nhiệt độ 4ºC. - Khi xử lý nhiệt hoạt tính PPO giảm dần, tuy nhiên hoạt tính còn lại trong PPO vẫn còn duy trì đến 20% ở nhiệt độ 80ºC. - Bên cạnh đó, hoạt tính PPO trong khoai lang nhạy cảm với một số chất phụ gia gây ức chế, đặc biệt là sodium bisulfite, acid ascorbic có khả năng ức chế hoạt động PPO hơn 60% nồng độ sử dụng rất thấp, sodium chloride và acid citric có khả năng ức chế yếu.. - Nghiên cứu sự biến đổi hoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong quá trình lên men cacao