- CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU - ORIGINAL PAPERS. - CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN BODERTELLA PERTUSSIS TRỰC TIẾP TỪ BỆNH PHẨM LÂM SÀNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP. - Ho gà, bệnh đường hô hấp, do vi khuẩn Bodertella pertussis gây ra, dễ lây nhiễm, có thể đe dọa tính mạng và là nguyên nhân chính gây bệnh và tử vong ở trẻ em, đặc biệt trẻ dưới 6 tháng tuổi. - Ở Việt Nam, mặc dù việc tiêm vắc xin phòng bệnh ho gà đã được triển khai nhiều năm, nhưng số ca mắc ho gà vẫn xuất hiện, có xu hướng mắc ở trẻ trưởng thành và người lớn với triệu chứng ho cấp tính hoặc mạn tính.Phương pháp PCR xác định vi khuẩn bằng cặp mồi đặc hiệu BP-1 và BP2-MOD (thiết kế dựa vào IS481- trình tự cài) có ngưỡng phát hiện 1vk/. - pư, độ đặc hiệu cao đã được sử dụng để chẩn đoán trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng. - Kết quả cho thấy 23,5%. - (24/102) bệnh nhi trong nghiên cứu dương tính với PCR, bao gồm trẻdưới 3 tháng tuổi (33,3. - Hầu hết trẻ đã điều trị kháng sinh và nhập viện với các triệu chứng không điển hình. - Vì vậy, để chẩn đoán phát hiện bệnh ho gà sớm, các bác sĩ cần quan tâm đến bệnh nhân có triệu chứng ho kéo dài và/hoặc sốt. - Trong tương lai, việc áp dụng PCR chẩn đoán bệnh ho gà tại các phòng xét nghiệm bệnh viện là cần thiết và khả thi.. - Ho gà là bệnh lây nhiễm cao, thường biểu hiện cấp tính ở đường hô hấp, gây nên bởi vi khuẩn Bordetella pertussis, là trực khuẩn Gram âm [1]. - Bệnh thường gặp ở trẻ nhỏ với các triệu chứng điển hình như cơn ho kịch phát, làm trẻ khó thở, thở nhanh, kèm theo tiếng rít ”whoop”. - cuối mỗi cơn ho, dễ gây tử vong nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời [2]. - Gần đây, các nghiên cứu chỉ rarằng tỷ lệ mắc bệnh đã tăng trở lại do có biểu hiện nhiễm bệnh ở trẻ vị thành niên và người lớn, ngay cả ở các nước phát triển đã thực hiện chương trình tiêm phòng đầy đủ [3].. - Các triệu chứng biểu hiện thường không điển hình hoặc kết hợp với bội nhiễmcác vi khuẩn khác như Hemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, gây khó. - Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới ước tính, năm 2008 tỷ lệ mắc ho gà là khoảng 16 triệu trường hợp, trong đó 95% ở các nước đang phát triển, và xấp xỉ 195.000 trường hợp chết do ho gà. - Theo kinh điển, ho gà được chẩn đoán bằng phương pháp nuôi cấy, huyết thanh học, huỳnh quang trực tiếp. - Các phương pháp này hiện không thiết thực cho chẩn đoán sớm bệnh do bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố: Chất lượng mẫu bệnh phẩm,thời gian vận chuyển bệnh phẩm, do việc tiêm phòng hay sử dụng kháng sinh trước. - Gần đây, nhiều nghiên cứu đã công bố PCR xác định vi khuẩn B.pertussis bằng cặp mồi đặc hiệu BP-1 và BP2-MOD (thiết kế dựa trên IS481- trình tự cài) có ngưỡng phát hiện 1vk/pư, độ đặc hiệu cao (không phản ứng chéo với các vi khuẩn gây viêm đường hô hấp) và đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán . - Ở Việt Nam, tỉ lệ bệnh ho gà đã giảm sau khi thực hiện chương trình tiêm chủng mở rộng, nhưng vẫn xuất hiện các ca bệnh ở trẻ dưới 3 tháng tuổi và từ 6-12 tuổi. - Năm 2011, 105 ca ho gà đã được báo cáo và số ca bệnh trong năm 2012 gần tương tự với 98 ca. - Tuy nhiên, số liệu này thu thập từ các ca bệnh được chẩn đoán dựa vào dấu hiệu lâm sàng. - Hơn nữa, kỹ thuật chẩn đoán phòng thí nghiệm như nuôi cấy, huyết thanh học thường âm tính do bệnh nhân đã tự điều trị kháng sinh dài ngày và chỉ phát hiện được kháng thể IgG (khó phân biệt với kháng thể sinh ra do việc tiêm phòng vắc xin). - Mặc dù các phòng thí nghiệm của chúng ta đã thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán nhiều tác nhân gây bệnh nhưng PCR chưa được ứng dụng trong chẩn đoán B. - Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định tỉ lệ bệnh nhi mắc bệnh ho gà tại một số bệnh viện ở Hà Nội bằng kỹ thuật PCR, góp phần phát hiện sớm bệnh và tăng hiệu quả điều trị, tránh lây lan trong cộng đồng.. - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu bệnh phẩm và tiêu chuẩn chọn. - Từ tháng 1 đến tháng 12/2013,cácmẫu dịch tỵ hầu được thu thập từ các bệnh nhi dưới 1 tuổi và 6-12 tuổi tại bệnh viện Việt Nam – Cu Ba, Nhi Trung ương với các triệu chứng: sốt, ho kéo dài, ho cơn, chảy nước mũi. - Các mẫu bệnh phẩm được xử lý, tách ADN và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi BP1/BP2-MOD (IS481- 151bp) [6].. - 2.2 Chủng vi khuẩn quốc tế. - Chủng vi khuẩn B.pertussis: 1 chủng B.pertussis ATCC®9340 (nguồn MediMark® Europe, Pháp) được nuôi cấy, tách ADN và làm chứng dương cho phản ứng PCR.. - Chủng B.pertussis ATCC®9340được nuôi cấy trên môi trường Charcoal có 10% v/v máu cừu và 40mg/mlkháng sinh cephalexin (Thermo Scientific), để trong điều kiện ẩm, ở 35 0 C-37 0 C từ 3-5 ngày. - Chủng vi khuẩn: Khuẩn lạc B.pertussis trên môi trường nuôi cấy được cho vào týp effendorf 1,5 ml chứa 1ml muối sinh lý 0,85% vô trùng.. - Nồng độ vi khuẩn được xác định 1,5x 108vk/ml, ủ ở nhiệt độ từ 95-99 0 C/30 phút, ly tâm 8000 vòng/. - Hút lấy phần dịch nổi, sử dụng làm chứng dương cho phản ứng PCR.. - Bệnh phẩm lâm sàng: Tăm bông lấy bệnh phẩm chuyển từ týp vận chuyển sang týp eppendorf 1,5 ml chứa 1ml nước muối sinh lý 0,85% vô trùng. - Hút lấy phần dịch nổi, sử dụng làm ADN cho phản ứng PCR.. - 2.3.3 PCR phát hiện IS481. - PCR phát hiện sự có mặt của ADN B.pertussis trong mẫu bệnh phẩm sử dụng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các vùng thuộcchuỗi trình tự cài (IS 481) của B.pertussis với kích thước của sản phẩm PCR 151 bp là: BP-1 (GATTCAATAGGTTGTATGCATGGTT) và BP2- MOD (TGGACCATTTCGAGTCGACG) [6].. - KẾT QUẢ. - 102 mẫu bệnh phẩm đã được thu thập bao gồm 92 mẫu từ bệnh nhi dưới 6 tháng tuổi và 10 mẫu của trẻ 2-12 tuổi. - Trong đó 75 bệnh nhi có triệu chứng giống bệnh lý lâm sàng của bệnh ho. - gà: chảy nước mũi, ho nhiều từng cơn, ho kéo dài (>7 ngày), mặt đỏ, sốt, nôn, 25 bệnh nhi dưới 2 tháng tuổi chưa được tiêm vắc xin phòng bệnh.. - Hầu hết các bệnh nhi đã được điều trị kháng sinh tại nhà (thời gian điều trị ít nhất 3 ngày) và đến khám sau 2 tuần khi xuất hiện triệu chứng khởi phát. - Duy nhất một trường hợp chưa dùng kháng sinh là bệnh nhi tại bệnh viện Nhi Trung ương 24 ngày tuổi, có triệu chứng ho liên tục từng cơn, mặt đỏ, sốt nhẹ, suy hô hấp độ 2.. - Kết quả nghiên cứu cho thấy trường hợp dương tính với PCR-B.pertussis. - Tuy nhiên, không có sự khác biệt giữa kết quả PCR sử dụng ADN tách từ mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp nhiệt (ủ ở 98 0 C/30 phút) vàsử dụng kít thương mại (QIAamp, Đức) (Hình1).. - Kết quả PCR sử dụng cặp mồi BP1/BP2-MOD phân tích ADN tách bằng phương pháp nhiệt và kít thương mại (QIAamp). - Tất cả các bệnh nhi được xác định PCR dương tính có biểu hiện ho cơn, ho kéo dài, trong đó 41.7%. - (10/24) có triệu chứng ho kèm theo sốt và viêm long đường hô hấp, tiếp theo là bệnh nhi với triệu chứng ho kéo dài, viêm long đường hô hấp, nôn (25%) và bệnh nhi có triệu chứng sốt kèm ho (16.7%) (Bảng 1).. - Kết quả PCR và bệnh phẩm lâm sàng. - Ho cơn, ho kéo dài 4 6 10. - Ho cơn, ho kéo dài + viêm long + nôn 6 14 20. - Sốt + ho cơn, ho kéo dài 4 48 52. - Trong các trường hợp PCR dương tính có là trẻ chưa được tiêm chủng vắc xin phòng Bạch hầu – Ho gà – Uốn ván – Bại. - Kết quả PCR và tình trạng tiêm phòng vắc xin của bệnh nhi Tiền sử. - Chưa tiêm vắc xin. - Tiêm chưa đủ 3 liều vắc xin. - Tiêm đủ 3 liều vắc xin. - Tiêm đủ 3 liều vắc xin + mũi 4 lúc 6 tuổi. - PCR dương tính . - Trên thế giới, mặc dù việc tiêm vắc xin phòng bệnh đã được thực hiện tốt nhưng số ca mắc ho gà ngày càng tăng và xuất hiện ở cả đối tượng thanh thiếu niên và người lớn. - Trong số ca nhập viện, nhóm trẻ dưới 1 tuổi chiếm tỉ lệ cao nhất, dễ biến chứng và tử vong vì nhóm này chưa được tiêm vắc xin phòng bệnh đầy đủ [7].. - Gần đây, việc phát hiện axít nucleic đã được sử dụng như một công cụ chẩn đoán trong phòng thí nghiệm vi sinhs y học. - Hiện tại các phòng thí nghiệm vi sinh y học tại Việt Nam đã được trang bị khá đầy đủ hệ thống PCR phục vụ chẩn đoán các tác nhân gây bệnh.Tuy nhiên, ở nhiều phòng thí nghiệm tại bệnh viện, việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật này chưa phổ biến, đặc biệt với vi khuẩn B. - có nghiên cứu cho rằng PCR sử dụng cặp mồi thiết kế dựa trên vùng trình tự cài đặc hiệu cho B. - Trong nghiên cứu trên bệnh nhân mắc ho gà tại Hà Lan và Đan Mạch cho thấy B.. - Hầu hết các phòng thí nghiệm sử dụng PCR với cặp mồi thiết kế thuộc IS481 đều cho độ nhạy cao và thấy rằng sự liên quan của B. - Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng PCR đã tiến hành với 14 chủng B.bronchiseptica, 1 chủng B. - Theo kết quả nghiên cứu năm 2008, nhóm tác giả đãchỉ raPCR sử dụng cặp mồi BP1/BP2-MOD được thiết kế dựa trên vùng IS481, đảm bảo độ nhạy của phương pháp bằng phát hiện tác nhân với 1vk/phản ứng và độ đặc hiệu của cặp mồi BP1/BP2-MOD cho quá trình khuếch đại B. - pertussis khi các mẫu ADN của các vi khuẩn gây bệnh hô hấp khác như K. - pneumoniae đều cho kết quả âm tính với PCR. - Do vậy, việc sử dụng phương pháp nhiệt để tách ADN trực tiếp từ bệnh phẩm dịch tỵ hầu có thể thay thế cho việc sử dụng kít thương mại, góp phần giảm giá thành và thời gian chẩn đoán bệnh.. - Việc sử dụng PCR cho chẩn đoán B. - pertussis có thể phát hiện sớm bệnh ho gà trong vòng 1-2 ngày, đặc biệt là ở nhóm trẻ sơ sinh [ 7, 11], trong khi B.pertussis là vi khuẩn rất khó phân lập trong phòng thí nghiệm [ 4, 6, 7]. - Phương pháp nuôi cấy và huyết thanh học có thể phát hiện được vi khuẩn ở tuần thứ 3 hoặc 4 của bệnh, nhưng rất khó xác định nếu bệnh nhân đã dùng kháng sinh và/hoặc được tiêm phòng trước đó [7]. - Hơn nữa, trẻ nhỏ dưới 1 năm tuổi là nhóm tuổi chưa được tiêm phòng vắc xin đầy đủ, triệu chứng lâm sàng thường biểu hiện không điển hình. - Do vậy, ở đây, PCR được coi là phương pháp chẩn đoán nhanh B.pertussis và có độ nhạy hơn so với nuôi cấy và huyết thanh học [1, 4, 6]. - Kết quả trong nghiên cứu nàycho thấy 23,5% PCR dương tính với B.pertussis chứng tỏ PCR có giá trị khi phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn. - bệnh nhi ở độ tuổi >. - bệnh nhân đã điều trị kháng sinh và bệnh nhi đã và đang tiêm phòng vắc xin. - Thông thường, trong các trường hợp này, số lượng vi khuẩn tập trung ở vùng hầu họng là rất thấp, việc sử dụng kháng sinh cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn nên kết quả chẩn đoán bằng nuôi cấy thường là âm tính [7]. - Trong khi đó, PCR sử dụng cặp mồi BP1/BP2-MOD có khả năng phát hiện tác nhân với ngưỡng phát hiện là 1vk/pứ và vi khuẩn ở tình trạng sống hoặc chết.. - Điều này cũng được chứng minh trong nghiên cứu bằng tỉ lệ phát hiện B.pertussis ở bệnh nhi đã điều trị kháng sinh (95,8%) và tiêm phòng vắc xin (62,5. - Mặt khác, kết quả nghiên cứu cho thấy 100% bệnh nhi có PCR dương tính có triệu chứng lâm sàng ho cơn, kéo dài, trong đó 41.7% bệnh nhi có biểu hiện ho kèm sốt và viêm long đường hô hấp. - Không thấy sự khác biệt giữa nhóm bệnh nhi PCR dương tính và âm tính về biểu hiện lâm sàng chỉ có ho cơn, ho kéo dài. - Nhóm bệnh nhi có triệu chứng sốt, kèm ho cơn, ho kéo dài thì tỉ lệ PCR dương. - Điều này chứng tỏ, tỉ lệ bệnh nhi mắc ho gà không phải là phổ biến so với các bệnh viêm nhiễm đường hô hấp khác.. - Tuy nhiên, việc chẩn đoán bệnh sẽ giúp các bác sĩ lâm sàng sàng lọc để đưa ra phác đồ điều trị phù hợp. - Mặt khác, việc phát hiện các bệnh nhi đã tiêm phòng vắc xin có triệu chứng lâm sàng và kết quả PCR dương tính với B.pertussis cần được tiếp tục theo dõi, nghiên cứu sâu và với số mẫu lớn hơn để có kết luận cụ thể, chính xác.. - Thêm nữa, thông thường trẻ nhỏ không biểu hiện triệu chứng điển hình của bệnh ho gà, vì vậy nếu các bác sĩ lâm sàng lưu tâm đến bệnh và yêu cầu xét nghiệm sớm thì khả năng chẩn đoán sàng lọc sẽ cao, giúp tăng hiệu quả điều trị, phòng ngừa bệnh lây lan trong cộng đồng, và bổ sung số liệu cho công tác giám sát bệnh dịch. - Ngoài ra, với sự biến đổi về triệu chứng lâm sàng của bệnh, ho gà cũng cần được quan tâm để chẩn đoán ở trẻ trưởng thành và người lớn khi có triệu chứng hokéo dài [12]. - Đồng thời, việc chẩn đoán phân biệt bệnh ho gà và các bệnh nhiễm trùng hô hấp do các tác nhân khác cũng rất cần thiết. - Trong trường hợp này, PCR rõ ràng là công cụ chẩn đoán nhanh, đơn giản và hữu hiệu. - Tuy nhiên, một bệnh nhân có kết quả PCR dương tính cũng cần có sự kết hợp với triệu chứng lâm sàng để đưa ra quyết định chính xác hoặc có thể kết hợp với kết quả huyết thanh học.. - Bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi BP1/. - BP2-MOD thuộc vùng IS481 của B.pertussis, 23,5% bệnh nhi có biểu hiện viêm đường hô hấp đã được chẩn đoán mắc bệnh ho gà tại mộ số bệnh viện ở Hà Nội. - Thêm nữa, việc phát triển PCR đa mồi để phát hiện B.pertussis và các tác nhân vi khuẩn gây bệnh hô hấp trong cùng một phản ứng là hướng nghiên cứu tiếp theo cần được quan tâm.. - Leber, A.L., Pertussis: Relevant Species and Diagnostic Update. - H.T.T.H., Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn Bodertella pertussis tại Việt Nam. - showed of pediatric patients were B.pertussis -PCR positive, including chil- dren were less than 3 months (33,3