- ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, DI TRUYỀN CÁC DÒNG HOA CHUÔNG (Gloxinia speciosa) ĐƯỢC CHIẾU XẠ. - Chiếu xạ, dòng biến dị. - Gloxinia speciosa, phân tích di truyền. - Hoa chuông (Gloxinia speciosa) là cây thân thảo, kiểu hoa đẹp, hoa có nhiều màu sắc khác nhau, và là cây trồng có giá trị kinh tế cao. - Với mục tiêu phát triển nhiều dòng hoa chuông mới có kiểu hình hoa lạ, độc đáo phục vụ nhu cầu thị trường, các mô sẹo của dòng hoa chuông đỏ kép được chiếu xạ bằng tia gama nguồn Co 60 với liều thích hợp 30 -150 Gy. - Sau các bước đánh giá thích hợp từ các mẫu chồi biệt hóa từ mô sẹo chiếu xạ trong giai đoạn in vitro được đánh giá đặc điểm hình kiểu hình và tiến hành đánh giá ở điều kiện nhà màng. - Mười hai dòng hoa chuông biến dị mang một số đặc tính khác biệt so với dòng đối chứng về kiểu hình hoa, lá được chọn lọc. - Kết quả phân tích di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD các dòng hoa chuông biến dị cho thấy giữa các dòng biến dị có sự sai khác về mặt di truyền với hệ số tương đồng di truyền 0,63. - Tổng hợp các kết quả phân tích, đánh giá hình thái và di truyền các dòng hoa chuông biến dị, dòng biến dị với đặc điểm như lá màu xanh nhạt, cánh hoa có tia màu trắng xuyên dọc, lượng gam màu trắng nhiều (dòng biến dị B) và mang các đặc điểm nổi trội được chọn. - Kết quả nghiên cứu này mở ra khả năng ứng dụng tia phóng xạ tạo đột biến hoa chuông và hướng tới tạo giống hoa chuông mới.. - Đánh giá đặc điểm hình thái, di truyền các dòng hoa chuông (Gloxinia speciosa) được chiếu xạ. - Cây hoa chuông (Florists gloxinias) có nguồn gốc ở Brazil năm 1789. - Hoa chuông là giống nhập nội vào nước ta trong những năm gần đây và đã xuất hiện khá rộng rãi trên thị trường. - Trên thế giới, hoa chuông được trồng phổ biến ở một số nước như: Brazil, Mexico, Mỹ, Hàn Quốc, Nhật,… Vẻ đẹp và hương thơm của loài hoa này nên thời gian gần đây nó được trồng rộng rãi ở những vùng trồng hoa có khí hậu phù hợp.. - Một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro thành công trong việc nhân giống cây hoa chuông từ phiến lá và chồi. - Một số nghiên cứu về việc khảo sát, đánh giá môi trường nuôi cấy, thành phần khác nhằm tìm ra môi trường nhân giống thích hợp cho cây hoa chuông.. - (2006) đã nhân giống cây hoa Chuông từ nuôi cấy phiến lá và chồi thành công. - Theo Minami, giá thể thích hợp để trồng cây là hỗn hợp đất mùn: chất khoáng: đá trân châu với tỷ lệ 2:1:0,5 thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa chuông (Minami and Salvador, 2005. - RAPD ra đời vào năm 1990, RAPD là marker di truyền trội, dựa trên kỹ thuật PCR nhưng không cần biết trước trình tự của DNA bản mẫu do đó được xem là một marker di truyền đơn, đánh giá mối quan hệ di truyền trên cây trồng. - Chính vì vậy, kỹ thuật RAPD là một trong những kỹ thuật được ứng dụng trong chọn giống bằng phương pháp gây đột biến.Trên thế giới, một vài nghiên cứu gần đây đã sử dụng kỹ thuật này để đánh giá sự di truyền của cây đột biến so với giống bố mẹ và đã minh chứng rằng kỹ thuật này hữu hiệu trong việc đánh giá sự khác biệt di truyền so với giống gốc.. - Kết quả cho thấy mức độ tương đồng di truyền của 18 giống dao động trong khoảng 0,40 đến 0,91. - Nghiên cứu được đề xuất thực hiện phân tích đánh giá hình thái, di truyền các dòng hoa Chuông được chiếu xạ với mục tiêu chọn, tạo dòng hoa Chuông mới làm phong phú thêm nguồn hoa kiểng tại Thành phố Hồ Chí Minh, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ cây hoa kiểng tại thành phố và các vùng lân cận.. - Mô sẹo được tạo từ cuống lá của hoa chuông đỏ kép trên môi trường MS + 1 mg/L NAA đặt trong điều kiện tối 1 tuần, nhiệt độ 23 0 C. - 2.2.1 Chiếu xạ và chọn lọc các dòng hoa chuông biến dị ở điều kiện in vitro. - Chiếu xạ 5 liều dao động xung quanh LD50 (LD50 là liều xạ mà tại đó số mẫu bị chết 50%) trong tổng số mẫu chiếu xạ nhằm lựa chọn liều chiếu xạ gây đột biến thích hợp đối với cây hoa chuông. - Quan sát, theo dõi đặc điểm hình thái (màu sắc lá, hình dạng lá), đặc điểm sinh trưởng của các mẫu hoa chuông đã được chiếu xạ.. - Các biến dị sau khi được quan sát sẽ được tiến hành chọn lọc cấy chuyền nhân dòng 3 lần (M1V2, M1V3, M1V4) (M1: Cá thể biến dị. - Cắt đốt thân chồi biến dị cấy sang môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L BA. - Các chồi biến dị được phát hiện sẽ tách riêng và tiếp tục nuôi cấy nhân chồi MS bổ sung 0,2 mg/L BA nhằm theo dõi tính ổn định của các biến dị đồng thời giúp tăng số lượng chồi biến dị trong 1 dòng.. - Các chồi chưa phát hiện biến dị trong điều kiện in vitro vẫn được tiếp tục lựa chọn để tái sinh cây hoàn chỉnh, sau đó được trồng ra vườn nhằm khảo sát các đặc điểm sinh trưởng phát triển của cây.. - 2.2.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng, phát triển và phân lập các dạng biến dị của các cây hoa chuông ở điều kiện nhà màng.. - Cây hoa chuông hoàn chỉnh (mỗi dòng 100 cây) ở thế hệ M1V4 có chiều cao từ 3–4 cm được trồng trên giá thể theo quy trình trồng và chăm sóc hoa chuông của Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, trên hệ thống tưới nhỏ giọt. - Đánh giá các biến dị dựa vào những khác biệt về màu sắc hoa, số lượng cánh hoa, hình dạng cánh hoa, hình dáng hoa, sự khác biệt về lá, thân, sự khác biệt về sinh trưởng và phát triển như chiều cao cây, thời gian ra hoa sớm, muộn,… Số liệu được phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm MSTATC.. - độ dày lá: dày, mỏng) để đánh giá mối quan hệ di truyền theo kiểu. - 2.2.3 Phân tích đa dạng di truyền các dòng hoa Chuông biến dị bằng kỹ thuật RAPD.. - Các dòng hoa chuông có mang biến dị về kiểu hình đã được đánh giá ở điều kiện nhà màng được phân tích sự đa dạng di truyền giữa các dòng biến dị với so với giống gốc ban đầu dựa trên kỹ thuật RAPD, xây dựng hệ số tương đồng trình tự và cây đa hình của giống gốc và các dòng biến dị. - Dựa trên kết quả phân tích kiểu hình của các dòng hoa chuông biến dị và có các đặc điểm khác biệt so với đối chứng, hoa có những đặc tính lạ và đẹp, cây sinh trưởng phát triển tốt đã được đánh giá ở điều kiện nhà màng sẽ được chọn để đánh giá bằng chỉ thị phân tử RAPD.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chiếu xạ và phân lập các dòng hoa chuông biến dị ở điều kiện in vitro. - Kết quả chiếu xạ giống hoa chuông có hoa đỏ kép ở liều xạ 30-150 Gy xuất hiện các kiểu hình lá cuốn tròn phát triển bình thường và ổn định qua các lần nhân dòng. - Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy các mẫu in vitro biến dị kiểu hình bạch tạng thì khả năng nhân nhanh thấp và chết sau một thời gian. - (2014), khi xây dựng quy trình nhân giống cây Đan Sâm đã xuất hiện các biến dị bạch tạng và những mẫu in vitro này không thể tiếp tục nhân nhanh.. - Bảng 1: Các cá thể biến dị ở giai đoạn in vitro của hoa Chuông đỏ kép sau 30 ngày cấy chuyền lần thứ 1. - Hình 1: Các biến dị in vitro đỏ kép sau khi chiếu xạ và cấy chuyền lần thứ 1 (A. - Đối chứng. - Lá xoăn lại, cụp xuống) Liều xạ Số chối hình thành Dạng biến dị Số cá thể biến dị Tần suất biến dị ( 0 / 00. - 3.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng, phát triển và phân lập các dạng biến dị của các cây hoa chuông ở điều kiện nhà màng. - Dựa trên đặc điểm hình thái như màu sắc lá, hình dạng của các dòng biến dị có sự khác biệt so với giống hoa chuông đối chứng, 12 cá thể hoa chuông biến dị ở giai đoạn in vitro được chọn để nhân dòng đến thế hệ thứ 4 (M1V4: cá thể biến dị với lần cấy chuyền thứ 4) tái tạo thành cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ở điều kiện nhà màng. - Mỗi dòng biến dị trồng 100 cây để đánh giá. - Cây hoa chuông trồng trên giá thể theo quy trình trồng và chăm sóc hoa chuông của Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, trên hệ thống tưới nhỏ giọt để tiến hành đánh giá các đặc tính nông học.. - Nhóm 1: Đối chứng và kiểu hình cánh hoa có điểm trắng nhiều (Tia trắng xuyên dọc cả cánh hoa). - Nhóm 2: Kiểu cánh hoa có ít điểm trắng (Tia trắng tập trung rải rác ở phần trên cánh hoa). - Hình 2: Một số biến dị kiểu hình hoa của hoa chuông đỏ kép ngoài nhà màng. - Về kiểu hình hoa, có 2 dạng chính là hoa kép không phân tầng như cây đối chứng và nhóm hoa phân thành 2 tầng đơn (I, J), hoa có kiểu hình cánh hoa có điểm trắng nhiều (B, E) là có đường kính lớn hơn đối chứng, trong khi kiểu hình D, H có đường kính nhỏ hơn đối chứng (Bảng 2, Hình 2).. - Bảng 2: Đánh giá kiểu hình hoa của các dòng biến dị ex vitro của mẫu hoa chuông đỏ kép. - Các biểu hiện biến dị Các kiểu. - hình biến dị Kiểu hình Kiểu hình tia màu trắng xuyên dọc cánh hoa, lượng gam màu trắng nhiều 3 B, C, D. - Kiểu hình có vệt/đốm/chấm màu trắng ở môi cánh hoa 3 E, F, G. - Kiểu hình có đốm trắng hình tròn ở cánh hoa 1 H. - Hoa to cánh hoa dài, cánh hoa có hình dạng không nguyên vẹn như đối chứng 2 K, L. - Cánh hoa có chiều hướng lên 3 D, G, L. - Cánh hoa có chiều hướng cong mềm mại như đối chứng 4 C, F, H, K. - Các cá thể biến dị kiểu hình hoa ở điều kiện nhà màng được chọn lọc để nhân giống vô tính ở điều kiện nhà màng và nhân giống in vitro từ củ, lá, thân.. - Kết quả ghi nhận ở Bảng 3 cho thấy về thời gian sinh trưởng của dòng có kiểu hình F, I và J dài hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với dòng đối chứng. - Các cá thể biến dị kiểu hình hoa ở điều kiện nhà màng được chọn lọc, nhân giống vô tính đến thế hệ. - Nhìn chung, ở tất cả các chỉ tiêu khảo sát các dòng đột biến đều tạo được khác biệt có ý nghĩa thống kê so với dòng đối chứng.. - Về chỉ độ bền hoa đây là chỉ tiêu khá quan trọng đối với hoa chuông vì là cây dùng làm cảnh, trang trí, dòng cho độ bền hoa tốt nhất là dòng B với độ bền hoa đạt 17,5 ngày tuy nhiên chưa tạo được khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. - biệt có ý nghĩa thống kê so với dòng đối chứng và tất cả các dòng còn lại với số nụ nhiều nhất đạt 16,4 nụ/cây. - Bảng 3: Một số tiêu chí đánh giá hoa chuông đỏ kép biến dị Kiểu. - hình Kiểu cánh hoa Thời gian. - điểm về kiểu hình như màu sắc hoa, hình dạng cánh hoa để phân tích mối quan hệ của các dòng hoa hoa Chuông biến dị với dòng đối chứng. - Theo đó, 28 đặc điểm về kiểu hình hoa Chuông đỏ kép được chọn phân tích trên 12 dòng kép biến dị để vẽ được sơ đồ phân nhóm di truyền trên nhóm này theo kiểu hình có mức độ tương đồng di truyền từ 0,54 đến 0,89 (Hình 3).. - Hình 3: Sơ đồ phân nhóm di truyền các dòng biến dị hoa chuông đỏ kép theo kiểu hình. - Kết quả trên cho thấy ở hệ số tương đồng di truyền là 0,69, 12 dòng biến dị hoa chuông đỏ kép được chia thành bốn nhóm chính.. - Nhóm I là nhóm lớn gồm 6 dòng biến dị B, C, G, E, F, L và dòng đối chứng A. - Giữa dòng A và dòng B có hệ số tương đồng cao nhất (0,89) với hoa có kiểu hình cánh hoa có điểm trắng nhiều, thời gian sinh trưởng, thời gian ra hoa như nhau, lá mỏng, hoa bền. - Dòng biến dị B có kiểu di truyền gần với dòng đối chứng theo di truyền hình thái, nên dòng này có khả năng sinh trưởng phát triển tốt như giống đối chứng nhưng có kiểu hình hoa khác đối chứng cánh hoa có tia trắng xuyên dọc, lượng gam màu trắng nhiều. - Bên cạnh đó, dòng biến dị E, F có hệ số tương đồng di truyền (0,85). - Nhóm II chỉ có một dòng biến dị H, hoa có đột biến đốm tròn trắng ở cánh hoa.. - Nhóm III cũng có một dòng biến dị D, cánh hoa có vệt trắng dọc cánh, cánh hoa hướng lên. - Nhóm IV có 3 dòng biến dị I, J, K với hệ số tương đồng 0,72. - Dựa vào phân tích di truyền giữa 12 dòng biến dị theo kiểu hình có thể chọn ra 4 dòng hoa chuông biến dị có đặc điểm hình thái sinh trưởng phát triển, đặc điểm hoa, hình dạng hoa đẹp và có đặc điểm khác biệt nhau gồm dòng B, dòng H, dòng D, dòng K. - Các dòng này được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền bằng kỹ thuật RAPD cùng với dòng đối chứng (dòng A).. - 3.3 Phân tích đa dạng di truyền các dòng hoa Chuông biến dị bằng kỹ thuật RAPD.. - Hình 4: Hình điện di 5 dòng hoa Chuông biến dị với mồi OPG13. - (Thang: 1kb, 1/ Đối chứng. - Kết quả PCR – RAPD của các dòng hoa chuông được mã hóa sang hệ nhị phân, tiến hành phân tích trên phần mềm NTSYS-pc version 2.1.. - Hình 5: Sơ đồ phân nhóm di truyền dòng biến dị hoa chuông đỏ kép theo kiểu gene Bốn dòng biến dị (dòng B, dòng G, dòng có lá. - xoăn lại cụp xuống và dòng có lá màu xanh pha hồng) được chọn để đánh giá di truyền bằng kĩ thuật RAPD cùng với dòng hoa chuông đối chứng với 10 mồi khác nhau. - Kết quả cho thấy năm dòng hoa chuông đỏ kép được phân thành 4 nhóm với mức độ tương đồng di truyền 0,63. - Trong đó nhóm 1 chỉ có dòng A là mẫu hoa chuông đối chứng. - Nhóm II có dòng B, G có hệ số tương đồng di truyền là 0,82, đồng thời phân tích về kiểu hình cho thấy thời gian sinh trưởng, thời gian ra hoa cũng như độ bền của hoa, lá mỏng, số nụ hoa, kích thước hoa như nhau nên có độ tương đồng về kiểu gene cao. - Nhóm III chỉ có dòng biến dị xoăn lại cụp xuống với. - Nhóm IV cũng có một dòng biến dị màu xanh pha hồng.. - Từ kết quả trên, dòng biến dị B được sử dụng để nhân giống vì có các đặc điểm như thời gian sinh trưởng ngắn, độ bền của hoa cao, hoa có đường kính lớn, cây sinh trưởng, phát triển tốt và khác biệt về mặt di truyền so với dòng đối chứng trong nghiên cứu này là 40. - Đồng thời các đặc tính về kiểu hình ổn định qua nhiều thế hệ. - Dòng biến dị này rất có triển vọng trong việc phát triển giống hoa chuông mới. - Chọn được 12 dòng biến dị có sự khác biệt về kiểu hình so với dòng đối chứng khi chiếu xạ bằng tia gamma Co 60. - Đặc điểm hình thái của 12 dòng hoa chuông biến dị trồng ở điều kiện nhà màng có tương đồng phân nhóm theo kiểu hình là 0,69 chia 12 dòng biến dị thành bốn nhóm chính. - Phân tích di truyền dựa trên kỹ thuật RAPD thì 4 dòng hoa chuông biến dị và dòng hoa chuông đối chứng được phân thành 4 nhóm với mức độ tương đồng di truyền 0,63. - Phân tích di truyền theo kiểu hình, kiểu gene chọn được dòng biến dị B trong các biến dị của hoa chuông đỏ kép mang các đặc tính hình thái nổi trội và có sự khác biệt về mặt di truyền, cũng như hình thái hoa so với giống đối chứng. - vọng có thể nhân và phát triển thành giống hoa chuông mới.