- TỨ BỘI (CITRUS RETICULATA BLANCO). - Nghiên cứu đã được thực hiện trên hai vật liệu khác nhau: cây con in vitro và mắt ghép trên cành bánh tẻ in vivo. - Mục tiêu của nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng nồng độ và thời gian xử lý colchicine để tạo ra thể tứ bội từ hai vật liệu này. - Kết quả ghi nhận chiều cao mẫu cây con in vitro tối ưu để xử lý colchicine là từ 3cm trở lên và ngưỡng chết 100% của mẫu là 24 giờ ở tất cả các nồng độ colchicine xử lý. - Tỉ lệ sống cao nhất của thí nghiệm này là hai nghiệm thức 0,05% và 0,1% trong 3 giờ xử lý. - Đối với thí nghiệm xử lý colchicine trên mắt ghép cành bánh tẻ, kết quả ghi nhận tỉ lệ sống của mắt ghép cao nhất ở giai đoạn ngay sau xử lý, sau ghép 20 ngày và tỉ lệ bật chồi cao nhất đều nằm ở 2 nghiệm thức 0,1% colchicine, 24 giờ và 0,2% colchicine, 48 giờ. - Cuối cùng, ngưỡng chết 100% của các mắt ghép là xử lý ở nồng độ colchicine 0,2% trong 72 giờ.. - Trong các phương pháp gây đột biến đa bội đặc biệt là tứ bội như gây chấn thương cơ giới, sốc nhiệt, tia rơnghen thì phương pháp hóa học đơn giản và nhanh nhất là xử lý các giống cây trồng nói chung và quýt nói riêng với colchicine để tạo giống quýt tứ bội.. - Đề tài “Đánh giá hiệu quả của colchicine trong chọn tạo giống quýt Hồng Lai Vung tứ bội (Citrus reticulata Blanco)” được thực hiện nhằm đánh giá khả năng ảnh hưởng của nồng độ colchicine và thời gian xử lý colchicine để tạo giống quýt Hồng Lai Vung tứ bội từ hai nguồn vật liệu: cành bánh tẻ và cây con được nuôi cấy mô từ hạt, xác định chiều cao cây con nuôi cấy mô thích hợp để xử lý colchicines và ứng dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào (flow cytometry) để phân tích mức bội thể của các mẫu đã xử lý đột biến.. - Thí nghiệm 1: Đánh giá tác động của colchicine đối với các mẫu cây con trồng trong ống nghiệm để tạo quýt Hồng Lai Vung tứ bội. - Nuôi cấy mô hạt quýt Hồng trong môi trường MS cơ bản, tạo thành cây con trong 4 tuần. - Tiến hành xử lý mẫu cây con với 4 nồng độ colchicine (0,01%. - 0,1%) ở 5 mốc thời gian (3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ, 24 giờ). - Trong thời gian xử lý, mẫu được lắc đều ở tốc độ 150 vòng/phút trong dung dịch. - Thí nghiệm được. - Quan sát cây con trồng từ hạt trong ống nghiệm từ sau khi xử lý colchicine đến 4 tuần để xác định: tỉ lệ sống, số chồi và lá phát sinh trên 1 mẫu xử lý, chiều cao gia tăng của mẫu.. - Đây là phương pháp kiểm tra mức đa bội của tế bào sau khi xử lý colchicine nhanh và chính xác hơn so với phương pháp đếm nhiễm sắc thể. - Thí nghiệm 2: Đánh giá tác động của colchicine đối với các mắt ghép để tạo quýt Hồng Lai Vung tứ bội. - Xử lý mắt ghép trên cành bánh tẻ với 4 nồng độ colchicine (0,1%. - 0,2%, 0,3% và đối chứng không xử lý) ở 3 mốc thời gian (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ). - Tổng số 9 nghiệm thức thí nghiệm. - Sau đó, ghép mắt ghép đã xử lý colchicine vào cây gốc ghép. - Quan sát các mắt ghép từ sau khi xử lý colchicine, sau khi ghép lên cây gốc ghép và đến khi bật chồi, phát sinh lá để xác định ảnh hưởng của colchicine lên các chỉ số phát triển các mắt ghép: tỉ lệ mắt ghép sống sót ngay sau thời gian xử lý, tỉ lệ mắt ghép sống sót sau khi ghép 20 ngày, số mắt ghép bật chồi, thời gian từ lúc ghép đến lúc bật chồi, số lá phát sinh từ mắt ghép.. - Sau khi ghép 5-6 tuần, các lá phát sinh từ các mắt xử lý được đánh giá sự thay đổi hình thái bằng cách quan sát dưới kính hiển vi xác định mật số khí khẩu trên 1 mm 2 và kích thước khí khẩu (µm) so với các mẫu đối chứng. - Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Plus v4.0. - 3.1 Đánh giá tác động của colchicine đối với các mẫu cây con in vitro để tạo quýt Hồng Lai Vung tứ bội. - 3.1.1 Tỉ lệ sống của các mẫu cây con nhị bội in vitro sau khi xử lý colchicine Sau 4 tuần theo dõi tỉ lệ sống của các cây con in vitro (Bảng 1), nhận thấy mặc dù nồng độ colchicine không làm các nghiệm thức có sự khác biệt ý nghĩa, nhưng từ tuần thứ hai trở đi, tỉ lệ sống cao nhất của cây con ở 0,05% colchicine xấp xỉ gấp 2 lần tỉ lệ sống thấp nhất của cây con ở 0,1% colchicine. - Tức là khi nồng độ tăng lên gấp đôi thì tỉ lệ sống gần như giảm một nữa. - (2003) ghi nhận trên cây có múi khi xử lý chồi ở nồng độ 0,05% colchicine, thời gian xử lý 48 giờ và 72 giờ gần như không có ảnh hưởng đến sức sống của chồi. - Khi nồng độ tăng lên gấp đôi, ảnh hưởng được biểu hiện rõ ngay ở thời gian xử lý 24 giờ. - Ở nồng độ 0,2% và thời gian 24 giờ, tỉ lệ sống giảm xuống 50%.. - Ngoài ra, nhận thấy rằng mốc thời gian 24 giờ, có thể là ngưỡng chết của các cây con quýt Hồng in vitro xử lý colchicine vì sang tuần thứ 2, toàn bộ các nghiệm thức xử lý ở 24 giờ đều chết.. - Bảng 1: Tỉ lệ sống. - của các mẫu cây con nhị bội in vitro sau 4 tuần xử lý colchicine ở nồng độ và thời gian khác nhau. - Nồng độ colchicine. - Thời gian xử lý (giờ). - Tỉ lệ sống. - của mẫu khi đưa vào xử lý colchicine, hạn chế nguyên nhân cây chết do quá yếu không thể chịu nổi nồng độ và thời gian xử lý. - Dựa vào mối tương quan giữa chiều cao cây con in vitro khi bắt đầu xử lý và tỉ lệ cây sống trong 4 tuần sau xử lý thể hiện trong bảng 2 kết luận rằng khi tiến hành xử lý nên chọn đồng loạt một khoảng chiều cao nhất địmh từ 3 cm trở lên và loại bỏ các mẫu có chiều cao quá thấp.. - Bảng 2: Tỉ lệ sống của cây khi xử lý colchicine ở các chiều cao cây khác nhau. - 3.1.3 Chiều cao cây gia tăng, số chồi và số lá phát sinh của các mẫu cây con in intro sau 4 tuần xử lý colchicine. - Sau thời gian xử lý colchicine, các mẫu được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA 10 mg/l và NAA 2 mg/l để kích thích sự phát sinh chồi mới. - Sau 4 tuần cấy chuyền, những cây con in vitro phát sinh chồi và lá mới, đồng thời cũng phát triển chiều cao (Hình 1). - Nhìn vào Bảng 3 nhận thấy, nồng độ colchicine không tạo ra nhiều sự khác biệt về số chồi phát sinh và chiều cao gia tăng. - nhưng trong cùng một nồng độ colchicine, 2 thông số này giảm dần khi thời gian xử lý tăng. - Ví dụ, ở nồng độ 0,1% colchicine, khi thời gian là 3 giờ số chồi phát sinh là 4, chiều cao tăng là 0,3cm. - khi thời gian tăng lên 6 giờ, số chồi phát sinh là 2, chiều cao tăng lên là 0,2cm. - (2003) cũng cho thấy số chồi dưa hấu của nghiệm thức không xử lý colchicine cao hơn nghiệm thức xử lý colchicine 4 ngày và số chồi càng thấp hơn khi tăng thời gian xử lý colchicine 7 ngày. - 2002), colchicine ảnh hưởng đến chiều cao của chồi có thể do nó tác động lên cytokinin và làm thay đổi tỉ lệ auxin/cytokinin trong tế bào, nên làm ảnh hưởng đến sự giãn dài tế bào.. - 2-3 cm cm cm cm Tỉ lệ sống. - Hình 1: Các mẫu cây phát sinh chồi, lá và gia tăng chiều cao sau khi xử lý colchicine 0.05%. - Chiều cao gia tăng. - 3.2 Đánh giá tác động của colchicine đối với các mắt ghép để tạo quýt Hồng Lai Vung tứ bội. - 3.2.1 Tỉ lệ sống của các mắt ghép sau khi xử lý colchicine và tỉ lệ các mắt ghép bật chồi, thời gian từ lúc ghép đến lúc bật chồi và số lá phát sinh từ mắt ghép Theo Bảng 5, trung bình có 70% mắt ghép còn sống ngay sau thời gian xử lý colchicine. - Nhìn chung, tỉ lệ sống sót giảm dần khi nồng độ colchicine và thời gian xử lý tăng lên. - Tỉ lệ sống cao nhất được thể hiện ở nghiệm thức 0,1%. - colchicine ở 24 giờ, so với tỉ lệ sống thấp nhất chỉ có 46% ở nghiệm thức 0,3%. - Trong 70% mắt ghép còn sống ngay sau xử lý đó, chỉ có tổng số 11% mắt ghép còn sống sau 20 ngày ghép, và 3% mắt ghép bật chồi. - Tỉ lệ không cao này có thể được giải thích bởi một số lý do sau: Thứ nhất, thời tiết mưa bão vào tháng 9 làm cho ẩm độ trong môi trường quá cao, khiến cho các mắt ghép đang trong giai đoạn tạo nhựa, liền mạch với gốc ghép tiết mồ hôi làm úng vị trí ghép, mắt ghép không được cây gốc ghép tiếp chất dinh dưỡng nên chết (Hình 2).. - Mặt khác, mắt ghép được ngâm trong colchicine trong thời gian đến 72 giờ, ngoài tác dụng của hóa chất làm giảm tỉ lệ sống và sức nảy mầm của các mắt ghép mà còn làm các mắt ghép dễ bị úng. - Điều này có thể thấy rõ khi so sánh tỉ lệ mắt ghép sống qua 20 ngày của mẫu đối chứng ngâm trong nước 72 giờ chỉ có 25%, và 0%. - mắt ghép bật chồi. - Ngoài ra, kỹ thuật ghép cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của các mắt ghép. - Thêm vào đó, tỉ lệ mắt ghép quýt Hồng Lai Vung sống và bật chồi trên các gốc ghép sau khi xử lý colchicine còn thấp cũng có thể do nguyên nhân tỉ lệ ghép thành công của các giống quýt là không cao so với các giống khác cùng họ Citrus. - (2003), tỉ lệ mắt ghép sống và bật chồi của Quýt Chum cao nhất là 40%, so với các giống cây có múi khác thì thấp hơn, như Cam Vân Du: 72%, Cam Sông Con 71%, Cam Sành 76%, Bưởi Phúc Trạch 68%.. - Hình 2: Sự sinh trưởng của các mắt ghép. - Bảng 3: Chiều cao, số lá và chồi gia tăng /mẫu cây con in vitro sau 4 tuần xử lý colchicine ở nồng độ và thời gian khác nhau. - Ghi chú: những nghiệm thức không có trong bảng là những mẫu đã chết sau 4 tuần xử lý. - 3.2.2 Mật số khí khẩu và kích thước khí khẩu của các mẫu lá phát sinh từ mắt ghép sau xử lý colchicine. - Hai nghiệm thức 0,1% colchicine xử lý trong 24 giờ và 0,2%. - Bảng 4: Mật số khí khẩu (số khí khẩu/mm 2 ) và kích thước khí khẩu (µm) của các mẫu lá phát sinh từ mắt ghép ở các nồng độ colchicine và thời gian xử lý khác nhau. - Chiều cao gia tăng/mẫu. - Thời gian. - xử lý (giờ) Nồng độ. - Mật số khí khẩu/mm 2. - Bảng 5: Tỉ lệ. - các mắt ghép bật chồi so với tổng số mắt ghép được ghép, thời gian từ lúc ghép đến lúc bật chồi và số lá phát sinh từ mắt ghép ở các nồng độ colchicine và thời gian xử lý khác nhau. - 3.3 Phân tích mức đa bội thể của các mẫu cây con in vitro còn sống sau 4 tuần. - Nồng độ Colchicine. - Tỉ lệ mắt ghép còn sống sau xử lý. - Tỉ lệ mắt ghép còn sống. - Tỉ lệ mắt ghép bật chồi(%). - Thời gian từ lúc ghép đến lúc bật chồi (ngày). - Số lá phát sinh từ một mắt ghép (lá) 0.1. - Hình 3: Hình chụp khí khẩu của các mẫu lá phát sinh từ mắt ghép sau xử lý colchicine. - Mẫu đối chứng là các mẫu quýt Hồng ở các xã trước khi xử lý colchicine. - Hình 4 và 5 lần lượt minh họa biểu đồ phân tích mức đa bội thể của mẫu cây con in vitro xử lý ở 0,05% colchicine trong 6 giờ và mẫu mắt ghép xử lý ở 0,1% colchicine trong 24 giờ.. - Hình 4: Biểu đồ minh họa giá trị trung bình của nội dung DNA nhân mẫu cây con in vitro xử lý ở 0,05% colchicine trong 6 giờ. - Hình 5: Biểu đồ minh họa giá trị trung bình của nội dung DNA nhân mẫu mắt ghép xử lý ở 0,1% colchicine trong 24 giờ. - Đối với các mẫu cây con trồng từ hạt in vitro, chiều cao thích hợp của mẫu khi xử lý colchicine là từ 3 cm trở lên. - Khi nồng độ colchicine xử lý tăng lên gấp đôi sẽ làm tỉ lệ sống của cây giảm đi một nửa. - Ngoài ra, trong cùng một nồng độ colchicine, số chồi phát sinh và chiều cao gia tăng của các mẫu trong quá trình cấy chuyền sẽ tỉ lệ nghịch với thời gian xử lý colchicine. - Mốc thời gian 24 giờ là ngưỡng chết 100% đối mẫu cây con in vitro này. - Tỉ lệ sống cao nhất được ghi nhận trong thí nghiệm là hai nghiệm thức colchicine 0,05% và 0,1% xử lý trong 3 giờ.. - Đối với các mắt ghép in vivo, tỉ lệ sống cao nhất của các mắt ghép sau khi xử lý colchicine, sau khi ghép 20 ngày và tỉ lệ bật chồi cao nhất đều nằm ở hai nghiệm. - Ngoài ra, nghiệm thức 0,2% xử lý trong 72 giờ là ngưỡng chết 100% của các mắt ghép in vivo này.. - Tiến hành lại thí nghiệm xử lý colchicine trên mắt ghép in vivo với số mẫu cao hơn và chọn thời gian ghép thích hợp từ tháng 6-8 (trước mùa mưa) để tăng tỉ lệ thành công của thí nghiệm. - Đối với thí nghiệm in vitro, nên tăng thêm hai mốc thời gian xử lý là 15 giờ và 18 giờ để xác định ngưỡng chết 100% của mẫu cây con in vitro chính xác hơn. - Ngoài ra, nên bố trí thời gian cấy chuyền các mẫu sau khi xử lý colchicine lâu hơn (10-15 tuần) để đánh giá hình thái chồi biến đổi, số lá phát sinh, chiều cao thân gia tăng so với mẫu đối chứng thuyết phục hơn.. - (Orchidaceae) by in vitro techniques”. - “Tạo dòng tứ bội thể ở cây cam Xã Đoài bằng xử lý colchicine chồi nuôi cấy trong điều kiện in vitro”