ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH THÁN THƯ (COLLETOTRICHUM OBICULARE 104T) TRÊN CÂY DƯA LEO (CUCUMIS SATIVUS CV. TSUYATARO) CỦA MỘT SỐ DÒNG ACTINOMYCETES NỘI SINH

- CÂY DƯA LEO (CUCUMIS SATIVUS CV.
- Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá khả năng chống chịu với một số điều kiện stress, khả năng phòng trừ bệnh thán thư (Colletotrichum orbiculare) trên cây dưa leo và khảo sát sự biểu hiện của các gene liên quan đến sự hình thành bệnh (Yoshida, 2009).
- Ba dòng nấm được đánh giá ở các chế độ nhiệt độ và 40 o C), trong môi trường bổ sung NaCl (0,5 và 1M) và pH (4 và 8).
- Khả năng kiểm soát sinh học của ba dòng Actinomyces được đánh giá bằng cách nhỏ giọt dịch chứa C.
- Kết quả cho thấy hai dòng A12 và A19 có thể đáp ứng tốt với nhiệt độ 35 và 40 o C.
- Dòng A12 và A16 đáp ứng tốt với nghiệm thức bổ sung 1M NaCl.
- Cả ba dòng có thể sinh trưởng tốt ở mức pH 4 và 8.
- Trong số ba dòng được đánh giá, A12 cho thấy khả năng phòng trị hiệu quả, làm giảm rõ rệt (p<.
- Dòng A12 ở mức OD 660 =2 cho kết quả phòng trị tốt nhất.
- Kết quả biểu hiện gene liên quan đến sự gây bệnh cho thấy lá thật xử lý với dòng A12 có mức biểu hiện gen PAL cao hơn so với đối chứng và các dòng khác..
- (1996) cho biết Bacillus pumilus dòng SE34 có thể phòng trừ bệnh thối rể trên cây đậu do nấm Fusarium oxysporum f.
- Các loài vi sinh vật nội sinh vừa có thể giúp phòng trừ bệnh vừa thúc đẩy sự sinh trưởng của cây ký chủ, do đó chúng hoàn toàn có thể được xem xét để phát triển thành các tác nhân phòng trừ sinh học và/hoặc thúc đẩy sinh trưởng.
- Shimizu et al., 2000) có thể được phát triển thành các tác nhân phòng trừ sinh học.
- Trong đề tài này, khả năng phòng trừ bệnh thán thư (Colletotrichum orbiculare) trên cây dưa leo của ba dòng Actinomyces đã được đánh giá.
- Ngoài ra, một số đặc tính chống chịu của các dòng đó cũng được khảo sát.
- Mục đích của thí nghiệm cuối của đề tài là nhằm xác định sự biểu hiện của một số gene liên quan đến sự hình thành bệnh (pathogenesis related –PR gene) trong cây dưa leo được xử lý với Actinomycetes..
- Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Bệnh Học Thực Vật (Laboratory of Molecular Biology Plant Pathology), Khoa Nông Nghiệp, trường đại học Okayama, Nhật Bản, trong đó bao gồm ba thí nghiệm được thực hiện theo trình tự..
- 2.2.1 Đánh giá khả năng chống chịu của ba dòng Actinomyces đối với một số điều kiện môi trường bất lợi.
- Có ba yếu tố môi trường được đánh giá: ảnh hưởng của nhiệt độ, hàm lượng muối (NaCl) và pH.
- Trong thí nghiệm về nhiệt độ, ba dòng Actinomyces được nuôi cấy trong môi trường IMA-2 dạng lỏng, sau đó được ủ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 23.
- Tương tự như yếu tố nhiệt độ, thí nghiệm về ảnh hưởng của muối có 2 nghiệm thức bổ sung 0,5 và 1M NaCl.
- Đối với yếu tố pH, tác động của môi trường acid (pH=4) và base (pH=8) đã được khảo sát.
- Thể nuôi cấy lỏng trong hai thí nghiệm pH và muối được ủ ở nhiệt độ 30 o C trong 4 ngày.
- Các thí nghiệm đều được lập lại ba lần, mỗi lần lập lại tương ứng với hai bình tam giác chứa 50 ml môi trường nuôi cấy IMA-2..
- 2.2.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát sinh học của ba dòng Actinomyces trên lá thật của cây dưa leo.
- Ba dòng Actinomyces được nuôi trong môi trường IMA-2 ở điều kiện nhiệt độ 30 o C, 120 rpm (round per minute) trong 5 ngày.
- Hạt giống dưa leo được khử trùng bằng ethanol 70% (1 phút) và NaClO 5% (5 phút) trước khi ủ nẩy mầm ở nhiệt độ 26 o C.
- Lá sau khi lây nhiễm được đặt trong môi trường ẩm độ cao trong 1 tuần.
- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 5 lần lập lại, mỗi lần lập lại có 4 cây con cho mỗi nghiệm thức lây nhiễm với Actinomycetes.
- Một thí nghiệm khác tương tự đã được thực hiện để xác định nồng độ lây nhiễm tốt nhất đối với dòng A12..
- 2.2.3 Biểu hiện (gene expression) của một số gene liên quan đến sự gây bệnh (Pahtogenesis relate-PR gene) bên trong cây dưa leo khi được lây nhiễm với 3 dòng Actinomyces.
- Hạt nảy mầm được lây nhiễm tương tự như thí nghiệm trên (nồng độ các dịch treo Actinomycetes được chỉnh về OD 660 =1).
- Tất cả các thí nghiệm (ngoại trừ thí nghiệm khảo sát sự chống chịu thuốc trừ nấm) được đề cập ở trên được phân tích biến lượng (ANOVA) để phát hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phần mềm SPSS version 16.
- 3 KẾT QUẢ.
- 3.1 Đánh giá khả năng chống chịu của ba dòng Actinomycetes đối với một số điều kiện môi trường bất lợi.
- 3.1.1 Sự chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi Sự chống chịu nhiệt độ.
- Đối với dòng A12, sự sinh trưởng ở nghiệm thức 40 o C trong 4 ngày đầu tiên thấp hơn so với ở các nghiệm thức nhiệt độ khác o C), đặc biệt là ở ngày thứ 3 và thứ 4, khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% (Hình 2).
- Có thể thấy rằng, dòng A12 có thể chống chịu tốt ở dãy nhiệt độ từ 23-40 o C, mặc dù ở những ngày đầu nuôi cấy sự sinh trưởng ở nhiệt độ 40 o C thấp hơn so với ở các điều kiện nhiệt độ còn lại.
- Sự sinh trưởng của dòng A16 trong 4 ngày cho thấy, ở nhiệt độ 40 o C, chỉ số OD 660 thấp hơn đáng kể so với các nghiệm thức nhiệt độ còn lại.
- Qua đó có thể kết luận rằng dòng A16 không thể chống chịu được nhiệt độ cao (40 o C), và nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của dòng A16 ở khoảng từ 23 đến 35 o C.
- Ngược lại, kết quả cho thấy dòng A19 chỉ có thể phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, 35-40 o C.
- Điều đó có thể thấy rõ nhất ở ngày nuôi cấy thứ 3 và 4, có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức nhiệt độ..
- Hình 2: Tác động của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của ba dòng Actynomycetes, A12 (A).
- Sự chống chịu muối.
- Vì thí nghiệm này được thực hiện chỉ nhằm xác định xem ba dòng Actinomycetes có đáp ứng được với tác động của môi trường có nồng độ muối cao hay không, do đó khả năng chống chịu muối của từng dòng đã không được so sánh với nhau trong kết quả thống kê.
- Hình 3 cho thấy, khi so sánh với sự sinh trưởng trên môi trường IMA-2 không bổ sung muối (đối chứng), dòng A12 có thể đáp ứng tốt với nghiệm thức bổ sung 1M NaCl.
- Tương tự, dòng A16 cũng cho thấy khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện có hàm lượng muối cao ở cả hai nghiệm thức bổ sung.
- Trái lại, dòng A19 chỉ có thể đáp ứng được với mức bổ sung 0,5 M NaCl..
- Hình 3: Tác động của muối (NaCl) đến sự sinh trưởng của ba dòng Actinomyces.
- Sự chống chịu với điều kiện acid và base.
- Tương tự thí nghiệm về sự chống chịu muối, sự đáp ứng của ba dòng Actinomyctes đối với các điều kiện pH khác nhau không được so sánh trong quá trình thống kê số liệu, thay vào đó là so sánh tác động của các mức pH môi trường khác nhau trong cùng một dòng Actinomycetes.
- Kết quả thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê về chỉ số OD 660 giữa các mức độ pH môi trường ở cả 3 dòng (Hình 4).
- Nói cách khác, cả ba dòng Actinomycetes được khảo sát đều có khả năng đáp ứng tốt với cả hai điều kiện môi trường acid (pH=4) và base (pH=8)..
- Hình 4: Tác động của pH đến sự sinh trưởng của ba dòng Actinomyces.
- 3.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát sinh học của ba dòng Actinomyces trên lá thật của cây dưa leo.
- Obiculare, có thể quan sát thấy trung bình có 6 vết bệnh hiện diện trên lá thật của cây con không được xử lý, trung bình của tổng diện tích vết bệnh là 140 mm 2 trên lá.
- thấp hơn so với xử lý với dòng A12 và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng không xử lý.
- Bên cạnh đó, trong một thí nghiệm tương tự, trong số 5 nồng độ được đánh giá, dòng A12 được áp dụng ở mức OD 660 =2 cho hiệu quả làm giảm diện tích và số bệnh tốt nhất (Hình 6).
- Có thể nhận thấy xu thế tăng dần hiệu quả cùng với sự tăng của nồng độ từ mức OD 660 =1 cho đến 2, trong đó hiệu quả giảm diện tích và số bệnh ở mức OD 660 =0.01 và 0.1 không khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng..
- obiculare trên lá thật của cây dưa leo đã được lây nhiễm trước với các dòng Actinomycetes.
- obiculare trên lá thật của cây dưa leo đã được lây nhiễm trước với dòng A12 ở các mức OD 660 khác nhau.
- 3.3 Biểu hiện (gene expression) của một số gene liên quan đến sự gây bệnh (Pahtogenesis relate-PR gene) bên trong cây dưa leo khi được lây nhiễm với 3 dòng Actinomyces.
- Trong số năm gene có liên quan đến hiện tượng Tính Kháng Hệ Thống Do Kích Ứng (Induced Systemic Resistance - ISR) (Shoresh et al., 2004) được biểu hiện trong thí nghiệm này, ba gene POX (peroxidase), Glu (β 1,3-glucanse) và.
- Chitinase được biểu hiện đồng đều nhau ở các nghiệm thức xử lý (Hình 7).
- Nói cách khác, gene POX, Glu (β 1,3-glucanse) và Chitinase được biểu hiện trong cây dưa leo mà không cần đến sự tác động của các dòng Actinomyces lây nhiễm trước..
- Mặt khác, có thể thấy rõ rằng, ở lá thật của cây con được xử lý trước với A12 cho thấy sự biểu hiện của gene PAL (phenyl alnine amonia-lyase) rõ hơn so với các cây con lây nhiễm với các dòng Actinomyces khác (A16 và A19) và nghiệm thức đối chứng (xử lý với nước).
- Như đã đề cập ở thí nghiệm trên, dòng A12 cho hiệu quả tốt nhất trong việc làm giảm số lượng và diện tích vết bệnh.
- Do đó, biểu hiện rõ rệt của gene PAL dưới tác động của dòng A12 có thể liên quan đến kết quả đó..
- Ngoài ra, sự biểu hiện của gene LOX (lipoxygenase) cũng cho thấy sự khác biệt rõ rệt ở các nghiệm thức xử lý.
- Sự biểu hiện của gene này chỉ xảy ra ở lá mầm của cây dưa leo được xử lý trước với các dòng Actinmycetes, đặc biệt là hai dòng A16 và A19..
- Hình 7: Biểu hiện (gene expression) của một số gene liên quan đến sự hình thành bệnh (Phathogenesis Gene - PR) trong lá thật và lá mầm của cây dưa leo được xử lý trước với các dòng Actinomycetes..
- Trong đề tài này, một số đặc tính chống chịu với các điều kiện bất lợi của ba dòng Actinomyctes đã được xác định.
- Các đặc tính đó đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá các đối tượng tiềm năng có thể được sử dụng như trong phòng trừ sinh học.
- Các kết quả cho thấy mức độ chống chịu có sự khác biệt giữa các dòng.
- A19 và A16 có thể phát triển tốt ở nhiệt độ cao (30-35 o C) (40 o C đối với A19), trong khi lại tăng sinh chậm ở nhiệt độ 23 o C.
- Trái lại, A12 tăng sinh chậm ở nhiệt độ 40 o C trong 3-4 ngày đầu.
- Sousa et al.
- Theo đó, cả ba dòng Actinomycetes trong đề tài này có khả.
- năng sống tốt ở môi trường pH 4.0-8.0.
- Điều đó phản ánh khả năng chống chịu tốt đối với điều kiện acid của ba dòng được khảo sát.
- Khoảng pH chống chịu được trong thí nghiệm này tương đồng với khoảng của dòng phân lập Streptomyces R-5 (pH từ tối ưu ở pH 5 - 6) (Shimizu et al., 2000)..
- Trong thí nghiệm của Sousa et al.
- (2008), sáu chủng phân lập được nuôi trên môi trường có bổ sung NaCl ở năm nồng độ khác nhau thay đối từ 1-3%.
- So với kết quả của thí nghiệm đó, cả ba dòng trong nghiên cứu này có khả năng sống tốt trong môi trường có lượng muối bổ sung tương đương 5,8%.
- Sự so sánh đó cho thấy khả năng chống chịu tốt của ba dòng Actinomycetes đối với muối..
- Như đã được làm rõ trong các thí nghiệm trên, trong số ba dòng Actinomycetes được khảo sát, A12 được xác định là dòng có khả năng hạn chế sự phát triển của bệnh thán thư.
- Kết luận đó được rút ra sự khác biệt có ý nghĩa trong việc làm giảm số lượng và diện tích vết bệnh trên lá thật của cây dưa leo khi só sánh hiệu quả đạt được của A12 các dòng khác, và nghiệm thức đối chứng.
- Các kết quả của Yoshida (2009) cho thấy không thể phân lập lại (re-isolate) các dòng Actinomycetes kể trên từ lá thật thứ nhất và thứ hai của cây dưa leo được lây nhiễm trước với cùng các tác nhân đó.
- Hơn nữa, không có hoạt động đối kháng diễn ra trong các thí nghiệm quan sát đặc tính đối kháng và kháng sinh (Yoshida, 2009).
- Sự suy giảm tỷ lệ bệnh gây ra bởi ba dòng Actinomycetes, do đó được dự đoán có liên quan đến tính kháng hệ thống đạt được do kích ứng (Induced Systemic Resistance - ISR).
- Do đó, biểu hiện rõ rệt của PAL trong lá thật được xử lý với A12 có thể liên quan đến kết quả đó.
- Tuy nhiên, cần tiến hành nhiều thí nghiệm hơn nữa để rút ra.
- Hai dòng A12 và A19 có thể đáp ứng tốt với điều kiện nhiệt độ cao (35-40 o C)..
- Dòng A12 và A16 có thể đáp ứng tốt với nghiệm thức bổ sung NaCl (1M) ở mức cao nhất.
- Cả ba dòng có thể sinh trưởng tốt trong cả hai điều kiện acid và base..
- Trong số ba dòng được đánh giá, A12 cho thấy khả năng phòng trị hiệu quả nhất thể hiện qua sự giảm rõ rệt (P<.
- Dòng A12 ở nồng độ tương ứng với OD 660 =2 cho kết quả phòng trị tốt nhất..
- Kết quả liên quan đến sự biểu hiện gene liên quan đến sự gây bệnh cho thấy lá thật xử lý với dòng A12 có mức biểu hiện gen PAL cao hơn so với đối chứng và các dòng khác..
- Có thể thực hiện thêm một số thí nghiệm để tối ưu hóa quá trình nuôi cấy dòng A12 phù hợp cho việc sản xuất chế phẩm ứng dụng..
- Cần tiến hành thêm một số thí nghiệm sinh học phân tử để làm rõ thêm cơ chế truyền tín hiệu trong quá trình hình thành tính kháng dưới tác động của ba dòng Actinomyctes.