Đánh giá sự đa dạng di truyền và tính kháng khuẩn của cây từ bi (Blumea balsamifera Lindl.)

- ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY TỪ BI (Blumea balsamifera LINDL.).
- Cây Từ bi, đa dạng di truyền, hoạt tı ́ nh kha ́ ng khuẩn.
- Để đánh giá sự đa dạng di truyền và khả năng kháng khuẩn của cây Từ bi, mười lăm mẫu cây Từ bi được thu thập từ nhiều nơi thuộc Đồng bằng sông Cửu Long (tı ̉ nh Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh, Đồng Tháp, Bạc Liêu và Hậu Giang), được phân tích đa dạng di truyền bằng ky ̃ thuật dâ ́u phân t ử RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) va ̀ thử hoạt tı ́ nh kháng khuẩn, xác đi nh nô ̣ ̀ng độ ứ c chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng trong thạch, trên 8 chu ̉ ng vi khuẩn tiêu biểu Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda.
- Kê ́t qua ̉ cho thấy ca ́ c mẫu Từ bi có sự đa dạng vê ̀ di truyền DNA và chia làm 4 nhóm với khoảng cách liên kết dao động từ 1,414 đến 5,196.
- Tất cả các nhóm Từ bi có khả năng ức chế mạnh nhâ ́t trên vi khuẩn Edwardsiella tarda (MIC=256 µg/ml), kế đến Edwardsiella ictaluri (256 µg/ml ≤ MIC ≤ 512 µg/ml, nho ́ m 3 mạnh nhâ ́t) và Staphylococcus aureus (512 µg/ml ≤ MIC ≤ 1024 µg/ml, hầu hết MIC=512 µg/ml).
- Khả năng kháng khuẩn của cao Từ bi thấp hơn trên Pseudomonas aeroginosa và Aeromonas hydrophila (1024 µg/ml ≤ MIC ≤ 2048 µg/ml), Streptococcus faecalis (1024 µg/ml ≤ MIC ≤ 4096 µg/ml) yếu nhất trên Escherichia coli (2048 µg/ml ≤ MIC >.
- Đánh giá sự đa dạng di truyền và tı́nh kháng khuẩn của cây từ bi ( Blumea balsamifera Lindl.
- Trong đó, cây Từ bi (Blumea balsamifera Lindl) thuộc họ cúc Asteraceae, thường được nhân dân dùng chữa cảm, sốt, ho, trừ đờm, đầy bụng không tiêu, đau bụng, dùng làm thuốc lợi tiểu, trị tăng huyết áp và sỏi thận…(Đỗ Huy Bích và ctv., 2004).
- Ở Thái Lan và Trung Quốc, cây Từ bi được dùng điều trị các vết thương nhiễm khuẩn (Ruangrungsi et al., 1985)..
- Trong y học cổ truyền Trung Quốc còn dùng cây Từ bi trị chàm, viêm da, lở loét da, đau lưng, tê phù, rong kinh, thấp khớp và diệt côn trùng (Chen et al., 2010).
- Lá cây Từ bi được dùng trị nhức đầu, nước sắc của lá và rễ cây được sử dụng để chống lại sốt và đau dạ dày (Ahmad and Ismail, 2003).
- Lá Từ bi cũng dùng trong điều trị sổ mũi, viêm họng, sốt, ho, cúm và các rối loạn tiêu hóa (Amornchai et al., 1997).
- Ở Philippine, lá của cây Từ bi được sử dụng chữa cảm lạnh (Amornchai et al., 1997).
- Các nghiên cứu đã cho thấy cây Từ bi có khả năng ứng dụng trong điều trị hoặc ngăn ngừa bệnh do vi sinh vật và có tác dụng mạnh nhất đối với Bacillus cereus, Staphylococcus aureus và Candida albicans, chất chiết xuất từ cây Từ bi có khả năng chống nhiễm trùng và chống sản xuất độc tố của vi sinh vật (Sakee et al., 2011).
- Tuy nhiên, sự thuần chủng của cây Từ bi vẫn chưa được nghiên cứu..
- Hiện nay, có rất nhiều phương pháp nghiên cứu về sự đa dạng di truyền như AFLP, FLP, RAPD, SSR, STS.
- Trong đó kỹ thuật RAPD là kỹ thuật đơn giản nhưng cũng xác định được sự đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử.
- (2009), ứng dụng phương pháp này đánh giá sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương địa phương nhằm tạo cơ sở cho việc tuyển chọn các giống đậu tương chịu hạn.
- Kỹ thuật RADP cũng được sử dụng trong nghiên cứu chọn lọc những cây thuốc.
- Nam có hoạt tính kháng khuẩn cao.
- Huỳnh Kim Diệu , và Phan Thị Tư (2015) ứng dụng chọn lọc dòng lược vàng có khả năng kháng khuẩn cao.
- Để góp phần nghiên cứu về sự thuần chủng và chọn lọc những dòng Từ bi có khả năng kháng khuẩn, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RADP được thực hiện trên cây Từ bi..
- 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu.
- Mười lăm mẫu cây Từ bi từ nhiều nơi thuô ̣c thuộc Đồng bằng sông Cửu Long (tı̉nh Hậu Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh, Đồng Tháp, Bạc Liêu) được thu mẫu (khoảng cách tối thiểu giữa 2 cây gần nhau nhất là 5 km) thực hiện phản ứng RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và các cây có sự khác biệt di truyền được trồng lại tại huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp , để lấy mẫu phân tích..
- 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền.
- Tách chiết DNA tổng số được thực hiện theo phương pháp CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) (Doyle, 1991), sử dụng 15 primer ngẫu nhiên (của công ty First BASE, Malaysia) cho kỹ thuật RAPD, mỗi primer dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự các primer sử dụng được trình bày trong Bảng 1..
- Bảng 1: Trình tự các nucleotide của 15 primer được sử dụng trong phương pháp chỉ thị RAPD STT RAPD.
- Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, thống kê các băng xuất hiện và không xuất hiện, phân tích Cluster, vẽ sơ đồ hình nhánh thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các giống dựa trên ma trận khoảng cách Euclidean, bằng phần mềm Statistica 5.5 theo phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean) (Sneath và Sokal, 1973)..
- 2.2.2 Thử tính kháng khuẩn.
- Các cây có sự khác biệt về di truyền được trồng lại trong cùng điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng.
- Sau 10 tháng, cây được sử dụng thử tính kháng khuẩn..
- Lá cây Từ bi được sấy khô và chiết bằng phương pháp ngâm dầm với methanol, loại bỏ.
- dung môi bằng máy cô quay đến cắn, được cao thô, dùng thử tính kháng khuẩn (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985)..
- Dùng phương pháp pha loãng liên tục trong thạch để xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimum inhibitory concentration) (Trương Công Quyền và ctv., 1986.
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sự đa dạng về di truyền.
- Hình 1: Kết quả điện di kiểm tra mẫu ly trích DNA của 15 mẫu cây Từ bi (Số thứ tự theo thứ tự cây mẫu).
- Để đánh giá sự đa hình của 15 mẫu cây Từ bi, 15 primer RAPD được sử dụng trong phản ứng PCR.
- Tỉ lệ đa hình thấp nhất ghi nhận được ở primer OPN16 (22,2%) và tỉ lệ đa hình cao nhất (100%) là primer OPB04, OPD02, OPE19 và OPE20 (Bảng 2)..
- Bảng 2: Kết quả sự đa hình từ marker RAPD ở 15 mẫu cây Từ bi được phân tích TT Primers Tổng số.
- băng DNA Số băng đa hình Tỉ lệ đa hình.
- Thứ tự băng đa hình.
- Primer OPB04: khuếch đại tổng số 6 băng có chiều dài trong khoảng 500–2.000 bp, tất cả đa hình (100%)(Hình 2)..
- chỉ băng đa hình.
- Có 9 băng đa hình chiếm tỉ lệ 100% (Hình 3)..
- Primer OPE19: khuếch đại tổng số 5 băng, chiều dài trong khoảng 400–1.650 bp, tất cả đều đa hình (100%) (Hình 4)..
- Tất cả đều đa hình chiếm tỉ lệ 100% (Hình 5)..
- Hình 6: Sơ đồ hình nhánh thể hiện mối quan hệ giữa các cây Từ bi theo kiểu phân nhóm UPGMA, dựa trên marker RAPD.
- Từ kết quả phân tích hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, bằng phương pháp UPGMA dựa trên 49 dấu RAPD, quan hệ giữa 15 mẫu cây Từ bi được thể hiện qua sơ đồ hình nhánh (Hình 6)..
- Dựa vào sơ đồ hình nhánh, cây Từ bi được phân thành 4 nhóm (Hình 6)..
- Nhóm 1 gồm 8 mẫu cây số .
- nhóm 1 có khoảng cách liên kết di truyền nằm trong khoảng .
- thấp nhất giữa cây số 7 và cây số 10.
- Nhóm 2 gồm 5 mẫu cây số và cây số 14.
- nhóm 2 có khoảng cách liên kết di truyền nằm trong khoảng .
- thấp nhất giữa cây số 9 và cây số 8.
- Nhóm 4 gồm cây số 5..
- Dựa vào bảng ma trận khoảng cách Euclidean giữa 15 cây Từ bi dựa trên kết quả phân tích marker RAPD cho thấy khoảng cách thấp nhất là 1,414 giữa cây 8 và cây 9, khoảng cách liên kết cao nhất là 5,196 giữa cây 5 và cây 1.
- Điều này chứng tỏ các mẫu Từ bi có sự đa dạng cao về mặt di truyền.
- Những cây có khoảng cách di truyền nhỏ thì gần giống nhau về mặt di truyền và tập hợp lại thành nhóm, cây có khoảng cách càng lớn thì càng khác nhau về mặt di truyền.
- Nguyên nhân khoảng cách di truyền lớn là do có sự biến dị di truyền trong tự nhiên khi cây thích nghi ở những điều kiện sống nhất định.
- có thể do ảnh hưởng của điều kiện sinh thái từng vùng hoặc thông qua quá trình chọn lọc tự nhiên đã dẫn đến sự khác biệt về mặt di truyền..
- 3.2 Thử tính kháng khuẩn.
- Theo phân tích sự khác biê ̣t di truyền, cây Từ bi được chia làm 4 nhóm và các nhóm này được trồng.
- Bảng 3: Nồngđộ ức chế tối thiểu của cao lá các nhóm Từ bi (µg/ml).
- Nhóm Vi khuẩn.
- Qua Bảng 3 cho thấy, các nhóm Từ bi đều có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn thử nghiệm, tuy nhiên khả năng ức chế của các nhóm Từ bi không giống nhau.
- Như vậy, sự khác biệt về di truyền cũng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng.
- Nhìn chung, nhóm 4 có khả năng ức chế tốt nhất, kế đến nhóm 1, nhóm 3 và nhóm 2..
- Các nhóm Từ bi đều ức chế ma ̣nh nhất trên vi khuẩn E.
- ictaluri (256 µg/ml ≤ MIC ≤ 512 µg/ml, nhóm 3 mạnh nhất) và S.aureus (512 µg/ml ≤ MIC ≤ 1024 µg/ml, chỉ nhóm 2 yếu hơn), yếu hơn trên P..
- Kết quả phù hợp với Metta và Rojanaworarit (2009) chiết xuất cây Từ bi bằng cồn và nước cho thấy Từ bi có khả năng ức chế S.
- 62,5 mg/ml (Sakee et al., 2011), chiết xuất lá Từ bi bằng methanol thì khả năng ức chế vi khuẩn S..
- Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với kinh nghiệm dân gian đã sử dụng lá Từ bi trị mụn nhọt, lở ngứa, viêm họng, ho, sốt, sổ mũi, ăn không tiêu, đau bụng (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)..
- Theo Ragasa et al.
- (2005), lá cây Từ bi có chứa icthyothereol acetate, cyptomeridiol, luteolin và beta-carotene.
- kiểm tra tính kháng khuẩn cho thấy có khả năng chống lại Pseudomonas aeruginosa,.
- Kết quả Bảng 3 cũng cho thấy tất cả các nhóm Từ bi có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sinh.
- tarda còn lây nhiễm từ cá gây bệnh cho người (Mainous et al., 2010) như gây nhiễm.
- trùng máu, viêm hệ thống niệu, viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm xương tủy, viêm dạ dày ruột, áp xe vòi trứng, áp xe vùng chậu, gây viêm phúc mạc, và cũng là nguyên nhân gây áp xe ở gan và bệnh kiết lỵ ở người (Janda et al., 1991).
- tarda huyết chiếm 40- 50% (Wang et al., 2005).
- tỉ lệ đề kháng oxytetracycline, tetracycline, nalidixic acid và sulfonamides cao hơn chloramphenicol, florfenicol, ceftiofur, cephalothin, cefoperazone, gentamicin, oxolinic acid, kanamycin và trimethoprim (Akinbowale et al., 2006).
- Theo Spencer et al..
- (2008), Nadirah et al.
- (2012) và Lee et al.
- ictaluri cũng đã đề kháng với rất nhiều kháng sinh mạnh (Tu Thanh Dung et al., 2008).
- Bên cạnh khả năng kháng khuẩn E.
- tarda, cao Từ bi cũng tác động tốt trên S.
- Ngoài khả năng gây bệnh, S.
- Theo Nawaz et al.
- quả của Ravinder et al.
- aureus được phân lập thì 36,4% đề kháng với streptomycin, 33,6% với oxytetracycline, 29,9% với gentamycin, 26,2% với chloramphenicol, pristinomycin và ciprofloxacin là 25,6% và theo Hossein et al.
- Trong khi cao của cây Từ bi có tác động mạnh trên 3 chủng vi khuẩn này (256 µg/ml≤MIC≤512 µg/ml) nên cây Từ bi rất có tiềm năng để sử dụng phòng và trị bệnh.
- Như vậy, nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cây Từ bi trên các chủng vi khuẩn có ý nghĩa đáng kể, để tìm ra những thuốc mới có khả năng điều trị bệnh trên con người và động vật, hạn chế được sự kháng thuốc và tạo sản phẩm động vật an toàn cho sức khỏe con người..
- Thông qua các dữ liệu chỉ thị RAPD cho thấy Từ bi có tính đa dạng di truyền và chia làm 4 nhóm.
- Các nhóm này đều có khả năng kháng khuẩn, ức chế tốt nhất trên vi khuẩn E.
- kỹ thuật phân tích tính đa dạng ADN được nhân bản ngẫu nhiên.
- Đánh giá sự thuần chủng và tính kháng khuẩn của cây hẹ (allium tuberosum roxb.
- Đánh giá sự đa dạng di truyền và tính kháng khuẩn của cây lược vàng (callisia fragrans lindl.
- Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc..
- Đánh giá sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của một số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương