- THANH LỌC CÁC GIỐNG LÚA. - MANG GEN KHÁNG RẦY NÂU BẰNG DẤU PHÂN TỬ DNA. - Để thanh lọc các giống lúa mang gen kháng rầy nâu (thuộc loại hình sinh học 2 và 3), 169 giống lúa được sử dụng để ly trích DNA và các mẫu DNA được khuếch đại với cặp mồi RG457FL/RL. - Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 750bp-800bp, chúng được cắt bằng enzyme cắt giới hạn HinfI với trình tự cắt là G/ANTC. - Vị trí cắt của enzyme HinfI khác nhau tùy vào giống mang kiểu gen dị hợp hoặc đồng hợp tử. - Trong đó, giống mang kiểu gen dị hợp tử gồm các băng với kích thước khoảng và 600bp. - giống mang kiểu gen đồng hợp kháng rầy nâu gồm các băng với kích thước khoảng 200, 250 và 350 bp. - giống mang kiểu gen đồng hợp nhiễm rầy nâu gồm các băng với kích thước khoảng 600 và 200 bp. - Ngoài ra, tính đa hình nucoletide đơn (SNP) cũng được dùng để xác định mức độ biến dị nucleotide giữa các giống. - Sự đa hình của gen Bph10 được xác định ở 29 giống lúa thể hiện tính kháng rầy nâu loại hình 2 và 3.. - Từ khóa: Dấu RG457, gen Bph10, phản ứng chuỗi, thanh lọc, rầy nâu. - Trước đây, khi nông dân trồng một vụ lúa trong năm thì rầy nâu rất ít xuất hiện. - Đây là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của rầy nâu về số lượng cũng như về chủng loại. - Hơn nữa, nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, quanh năm ẩm ướt cũng là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của rầy nâu. - Trong thời gian gần đây, ở phía nam mà đặc biệt là vùng ĐBSCL, rầy nâu cùng với bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá xuất hiện ngày càng nhiều và có lúc đã trở thành dịch, cao điểm là đại dịch. - Do đó, việc chọn tạo các giống lúa vừa có chất lượng cao, vừa kháng rầy nâu ở giai đoạn hiện nay được xem là vấn đề cấp bách và mang ý nghĩa quan trọng về mặt chiến lược. - Do đó việc “Thanh lọc các giống lúa mang gen kháng rầy nâu bằng dấu phân tử DNA” là rất cần thiết và cấp bách hiện nay.. - 2.1.1 Giống lúa. - 169 giống lúa được cung cấp từ Viện lúa ĐBSCL, Viện Nghiên cứu Phát triển ĐBSCL – Trường Đại học Cần Thơ (Bảng 1).. - Bảng 1: Danh sách các giống lúa thu thập. - 1 A0-OM4059 86 IR A0-OM4097 87 IR A0-OM4101 88 IR A0-OM4244 89 IR A0-OM4940 90 IR A0-OM5451 91 IR A0-OM5453 92 IR A0-OM6072 93 IR A0-OM6511-1 94 IR A0-OM6839 95 IR A1-OM 5199 96 IR A1-OM2494 97 IR A1-OM3689 98 IR A1-OM3955 99 IR A1-OM5464 100 Lúa phi (3). - Ghi chú: Các giống OM và IR được cung cấp từ Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, các giống còn lại từ Viện Nghiên cứu Phát triển ĐBSCL, Trường Đại học Cần Thơ. - Sau khi tách chiết DNA, tiến hành đo quang phổ xác định nồng độ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm và điện di trên gel agarose 0,8% với sự hiện diện của Ethidium Bromide (EtBr) để kiểm tra chất lượng DNA. - 2.2.2 Phản ứng PCR (DNA STS). - Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR Bio-Rad C1000. - Thành phần của phản ứng như sau: 50-100ng DNA, 3l PCR buffer ABgen 10X, 2l MgCl 2. - Phản ứng khuếch đại được tiến hành ở 95 o C trong 5 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với các bước như sau: biến tính ở 94 o C trong 1 phút, bắt cặp mồi vào khuôn ở 65 o C trong 45 giây, kéo dài ở 72 o C trong 2 phút. - Cuối cùng phản ứng được duy trì 72 o C trong 7 phút.. - 2.2.3 Phân tích sản phẩm PCR. - Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được phân tích bằng điện di gel agarose 1 – 2%. - chuẩn 100bp của công ty Invitrogen đã được sử dụng để ước lượng kích thước đoạn sản phẩm PCR. - Nếu các mẫu sản phẩm PCR cho băng sáng rõ và đều trên gel agarose, ta tiến hành lưu trữ để thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme HinfI.. - 2.2.4 Phản ứng cắt sản phẩm PCR. - Sản phẩm PCR (DNA STS) được cắt bằng enzyme HinfI với công thức được thể hiện như sau: 8µl DNA STS, 3µl enzyme HinfI 10U/µl (Invitrogen), 2µl RC buffer (50mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol, 500µg/ml BSA, 50% (v/v) glycerol), thêm BiH 2 O vào cho đủ thể tích 20µl, rồi đem ủ ở 37 o C trong 16 giờ.. - Sản phẩm của phản ứng cắt DNA STS được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1,5%. - Dựa vào số băng và kích thước của các băng thể hiện qua phổ diện điện di gel agarose để xác định các giống lúa mang kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp mang gen Bph10.. - 2.2.5 Phân tích tính đa hình của gen Bph10. - Chọn ngẫu nhiên ba mẫu đại diện cho ba nhóm giống lúa (mang kiểu gen đồng hợp kháng, đồng hợp nhiễm và dị hợp mang gen kháng) để tiến hành giải trình tự.. - Tiến hành phản ứng cycle sequencing (PCR gắn huỳnh quang) và tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ kit Invitrogen. - Bên cạnh, có sử dụng các chuỗi mã của đoạn DNA được khuếch đại từ các giống đối chứng là TN1 (giống nhiễm chuẩn) và Ptb33 (giống kháng chuẩn), cũng như chuỗi mã của giống lúa Oryza sativa đoạn chuỗi mã từ vị trí nucleotide thứ 28393 đến 29113 trên nhiễm sắc thể số 12. - Các chuỗi trình tự được phân tích để xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống bằng cách kết hợp với dữ liệu hiện có trên trang web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi đồng thời tiến hành phân tích tính đa hình của gen Bph10 bằng chỉ thị SNPs dựa vào phần mềm DNASP version 5.10.01.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phản ứng PCR. - Các mẫu DNA sau khi ly trích được kiểm tra trên gel agarose 0.8% với sự hiện diện của Ethidium Bromide, kết quả cho thấy các mẫu DNA đều cho một vạch sáng rõ, không bị lẫn các tạp chất khác, các mẫu DNA được lưu trữ cho các bước thí nghiệm tiếp theo.. - Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi STS (RG457FL/RL) với M là thang chuẩn 100bp, các giống lúa (tương ứng với số kí hiệu tại các giếng) cho băng thể hiện trên gel có kích thước khoảng 750-800bp (Hình 1). - Tuy nhiên, chỉ dựa vào sản phẩm PCR với dấu phân tử STS thì không thể xác định được giống lúa nào là kháng hay nhiễm rầy nâu vì kết quả của phản ứng không thể hiện được sự đa hình.. - Vì vậy, sử dụng enzyme cắt giới hạn HinfI để thực hiện phản ứng cắt sản phẩm PCR nhằm mục tiêu phát hiện ra sự đa hình của các giống lúa, từ đó xác định được các giống lúa là kháng hoặc nhiễm rầy nâu.. - Hình 1: Phổ diện điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. - 3.2 Kết quả phản ứng cắt sản phẩm PCR (DNA STS). - Phản ứng cắt enzyme thể hiện trên gel agarose chia thành 3 nhóm như sau: Nhóm I có 4 băng với kích thước khoảng và 600bp. - nhóm II có 3 băng thể hiện với kích thước khoảng 200, 250 và 350bp. - nhóm III có 2 băng thể hiện với kích thước khoảng 200 và 600bp so với thang chuẩn (Hình 2). - Đặc biệt, sự thể hiện băng của giống kháng chuẩn Ptb33 (kí hiệu 169) và giống nhiễm chuẩn TN1 (kí hiệu 168) lần lượt trùng khớp với sự thể hiện băng của các giống thuộc nhóm II (có 3 băng) và nhóm III (có 2 băng) (Hình 3).. - Hình 2: Kết quả cắt DNA STS theo công thức ổn định M: Thang chuẩn 100bp. - Giếng kí hiệu PCR không có sự hiện diện của enzyme trong phản ứng cắt. - Hình 3: Kết quả cắt DNA STS theo công thức ổn định M: Thang chuẩn 100bp. - Hình 4: Sản phẩm cắt DNA STS. - 1: IR54742, 2: IR IR IR IR . - (1999), sau khi khuếch đại DNA của các giống lúa với cặp mồi RG457FL/RL thì cho kết quả một băng rõ nét trên gel có kích thước khoảng 750–. - Sản phẩm PCR (DNA STS) được cắt bằng enzyme HinfI thì sản phẩm của phản ứng cắt trên hình gel như sau: kiểu gen đồng hợp kháng có ba băng với kích thước khoảng 200 bp, 250 bp, 350 bp. - kiểu gen đồng hợp nhiễm có hai băng với kích thước khoảng 200 bp và 600 bp. - kiểu gen dị hợp mang gen kháng bao gồm các băng thành phần của kiểu gen đồng hợp kháng và kiểu gen đồng hợp nhiễm (Hình 4).. - Theo kết quả của Lang et al. - (1999) thì 169 giống lúa nghiên cứu trong đề tài thanh lọc bằng dấu phân tử STS RG457, có 14 giống mang kiểu gen đồng hợp kháng rầy nâu: giống và 148. - 15 giống có kiểu gen dị hợp tử mang gen kháng: giống và 128 giống không có mang gen kháng rầy nâu.. - 3.3 Phân tích mối liên kết di truyền của gen Bph10. - Giải trình tự 3 giống đại diện các nhóm có kiểu gen đồng hợp nhiễm: 31 (A2- OM5472). - giống có kiểu gen dị hợp kháng: 27 (OM4940) và giống có kiểu gen đồng hợp kháng: 107 (IR và 2 giống đối chứng là giống nhiễm chuẩn: 168 (TN1) và giống kháng chuẩn: 169 (Ptb33). - Các chuỗi trình tự được phân tích và so sánh với ngân hàng dữ liệu trên trang http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, mối quan hệ giữa chúng được thể hiện như hình 5.. - Hình 5: Mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa được giải trình tự với giống đối chứng và giống Oryza sativa. - Theo hình 5 ta nhận thấy, các giống lúa đều có nguồn gốc từ giống Oryza sativa.. - Đặc biệt giống IR và giống kháng chuẩn PTB33 (hoặc giống A2- OM5472 và giống nhiễm chuẩn TN1) đều có kiểu gen là đồng hợp tử nhưng giữa chúng chỉ có mối quan hệ họ hàng gần gũi – có nghĩa là chúng vẫn có sự khác biệt.. - Kết quả phân tích với phần mềm DNASP version 5.10.01 cho thấy: Các dạng biến dị di truyền (đột biến) của các chuỗi trình tự gồm thay thế nucleotide cùng nhóm, thay thế nucleotide khác nhóm và indel nucleotide (thêm, mất nucleotide) tại những vị trí nhất định trên mỗi chuỗi. - Trong đó, phổ biến nhất là dạng thay thế nucleotide (bảng 2). - Do đó, giữa các giống mang kiểu gen đồng hợp kháng hoặc đồng hợp nhiễm hoặc kiểu gen dị hợp đều có sự khác biệt về chuỗi mã của gen Bph10 ở một số vị trí nào đó. - Đây cũng là cơ sở để giải thích vì sao mặc dù các giống có kiểu gen giống nhau nhưng phản ứng kháng với rầy nâu là khác nhau.. - Bảng 2: Các dạng biến dị di truyền của gen kháng rầy nâu Bph10. - Thay thế nucleotide khác nhóm A/C A C A A A. - 222 Thay thế nucleotide cùng nhóm G/A G A G G G 223 Thay thế nucleotide khác nhóm T/A T A T T T 228 Indel A - A A A - 234 Thay thế nucleotide khác nhóm G/C C G G G C 265, 281 Thay thế nucleotide cùng nhóm G/A A G G G A 283, 284 Thay thế nucleotide khác nhóm G/C C G G G C. - 285 Thay thế nucleotide cùng nhóm G/A A G G G A. - Thay thế nucleotide khác nhóm C/A A C C C A. - 295,299 C/A A C C C A 300 Thay thế nucleotide cùng nhóm A/G G A A A G. - Thay thế nucleotide khác nhóm. - 311 Thay thế nucleotide khác nhóm C/A A C C C A. - 317 Thay thế nucleotide cùng nhóm T/C C T T T C 319. - 322, 324 G/T T G G G T 326 Thay thế nucleotide cùng nhóm A/G G A A A G. - 328 Thay thế nucleotide khác nhóm T/A A T T T A 329 Thay thế nucleotide cùng nhóm C/T T C C C T 331 Thay thế nucleotide cùng nhóm T/C C T T T C. - 334, 335 Thay thế nucleotide khác nhóm A/T T A A A T 336, 337 Thay thế nucleotide cùng nhóm A/G G A A A G. - 339 Indel T - T T T - 342 Thay thế nucleotide khác nhóm C/A A C C C A. - 343 Thay thế nucleotide cùng nhóm A/G G A A A G 348, 349 Thay thế nucleotide khác nhóm T/G G T T T G 355 Thay thế nucleotide cùng nhóm C/T T T C C C 357. - 361 G/T T G G G T 363 Thay thế nucleotide cùng nhóm A/G G A A A G 364 Thay thế nucleotide khác nhóm A/T T A A A T 401 Thay thế nucleotide cùng nhóm G/A A G G G A 410, 411,. - Thay thế nucleotide cùng nhóm C/T T C C C T 452, 461 T/C C T T T C 496, 497 C/T C T C C C 498 Thay thế nucleotide khác nhóm A/T A T A A A 500. - 548 Thay thế nucleotide cùng nhóm T/C T T T T C 558. - Ứng dụng dấu phân tử STS RG457 và enzyme cắt giới hạn HinfI đã thanh lọc được 29/169 giống lúa mang gen Bph10 có khả năng kháng loại rầy nâu có. - Trong đó 14 giống mang gen đồng hợp kháng với rầy nâu.. - Các giống kháng mang gen đồng hợp Các giống kháng mang gen dị hợp Số. - 5 IR OM6073 67 6 IR IR 64 68. - 9 IR A0-OM4244 83 10 IR IR . - 11 IR IR IR IR IR IR IR PSB RC82) 148 14 IR . - Dấu SNPs tỏ ra hữu hiệu trong việc dự đoán tính đa hình giữa các giống lúa mang kiểu gen dị hợp hoặc đồng hợp kháng rầy nâu, thanh lọc được có tính đa hình cao.. - Đánh giá tính kháng của các tổ hợp giống lúa năng suất cao, phẩm chất tốt đối với quần thể rầy nâu tại ĐBSCL từ