- ĐỊNH DANH TỎI LÝ SƠN (Allium sativum L.) DỰA VÀO CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦ VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ. - Cấu trúc củ tỏi, chỉ thị phân tử, định danh, hình thái củ tỏi, tỏi Lý Sơn. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm góp phần định danh chính xác thương hiệu tỏi Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi thông qua các đặc điểm hình thái củ và chỉ thị phân tử. - Sáu loại tỏi đã được thu thập từ các địa phương trồng tỏi và các siêu thị có nguồn gốc rõ ràng bao gồm: Lý Sơn - Quảng Ngãi, Phan Rang - Ninh Thuận, Khánh Hòa, Đà Lạt - Lâm Đồng, Hải Dương và Trung Quốc. - Đã có tổng số 10 đặc điểm hình thái và cấu trúc của tỏi được đánh giá và 5 chỉ thị phân tử được sử dụng. - Theo kết quả nghiên cứu, tỏi Lý Sơn dễ dàng được phân biệt với tỏi Hải Dương, Lâm Đồng và Trung Quốc dựa vào màu sắc vỏ lụa, đường kính củ, đường kính vùng rễ. - Để phân biệt được tỏi Lý Sơn với tỏi Phan Rang và Khánh Hòa cần thông qua số lượng tép, đường kính củ và đường kính rễ. - Số lượng tép của tỏi Lý Sơn là tép. - đường kính củ cm. - đường kính vùng rễ cm. - Các chỉ thị cpSSR và cpSTR được thiết kế trong nghiên cứu chỉ cho phép phân biệt tỏi Lý Sơn với tỏi Phan Rang, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Trung Quốc. - Thông qua các chỉ thị phân tử cũng có thể khẳng định sự đồng nhất về mặt di truyền giữa tỏi Lý Sơn và tỏi Khánh Hòa.. - Định danh tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.) dựa vào các đặc điểm hình thái củ và chỉ thị phân tử. - Tại Việt Nam, loại cây này được trồng hầu hết ở các tỉnh thành, trong đó một số địa điểm nổi tiếng như Lý Sơn - Quảng Ngãi, Hải Dương, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Phan Rang. - Đặc biệt, trong số các loại tỏi của Việt Nam thì thương hiệu tỏi Lý Sơn được đánh giá là có giá trị kinh tế cao và đã được nhà nước công nhận thương hiệu tỏi quốc gia vào năm 2009.. - Theo số liệu báo cáo của UBND huyện Lý Sơn năm 2018, diện tích trồng tỏi trên đảo Lý Sơn hiện nay đạt 326,5 ha với năng suất 83,7 tạ/ha, sản lượng 2731,6 tấn. - Tỏi Lý Sơn là một trong số những giống tỏi có giá trị kinh tế cao, giá tỏi thường dao động từ đồng/kg. - Năm 2009, Hồ Huy Cường đã thực hiện đề tài nghiên cứu với mục đích khôi phục giống tỏi có năng suất cao, sinh trưởng và phát triển tốt trong các điều kiện khắc nghiệt của địa phương, giúp nâng cao đời sống của người dân trồng tỏi ở huyện đảo Lý Sơn.. - Tuy nhiên, hiện nay thương hiệu tỏi Lý Sơn đang phải đối mặt với nhiều thách thức, cụ thể như kỹ thuật canh tác còn chưa được hoàn thiện, năng suất và chất lượng tỏi còn phụ thuộc nhiều vào yếu tố tự nhiên (khí hậu, thổ nhưỡng), chưa có những nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyền, thành phần và hàm lượng các hoạt chất của loại tỏi này, nguồn giống tỏi Lý Sơn chưa được đảm bảo ổn định. - Đặc biệt, trên thị trường xuất hiện nhiều loại tỏi có xuất xứ và nguồn gốc khác nhau nhưng mang những đặc điểm. - hình thái củ tương đồng như tỏi Lý Sơn, dẫn đến sự xuất hiện của tỏi Lý Sơn giả.. - Việc phân biệt tỏi Lý Sơn với một số loại tỏi khác trên thị trường là điều hết sức khó khăn và chưa có bất kỳ một nghiên cứu cụ thể và cơ sở khoa học nào. - Điều này đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc bảo vệ thương hiệu tỏi Lý Sơn bản địa và niềm tin của người tiêu dùng.. - Bên cạnh đó, trong những năm gần đây để tăng độ chính xác và tin cậy của việc định danh sản phẩm nông nghiệp, có thể sử dụng công cụ chỉ thị phân tử (Kesawat and Das, 2009). - Trong đó, chỉ thị SSR (simple sequence repeats) được sử dụng tương đối rộng rãi vì tính phổ biến của nó trong hệ gen, khả năng lặp lại kết quả và mức độ đa hình cao, tính chất di truyền đồng trội (Hanci and Gokce, 2016). - Đối với tỏi, trong những năm gần đây, việc phân loại, đánh giá nguồn gen và tính đặc trưng của giống ở cấp độ phân tử đã được tiến hành bằng các chỉ thị SSR trong nhiều nghiên cứu (Chung and Staub, 2003. - Từ những cơ sở trên, nghiên cứu này đã được tiến hành với mục tiêu đề xuất được phương pháp định danh tỏi Lý Sơn hiệu quả trên thị trường dựa trên đặc điểm hình thái củ và đặc điểm di truyền của tỏi Lý Sơn bằng chỉ thị phân tử cpSSR (chloroplast simple sequence repeats) và cpSTR (chloroplast short tandem repeats). - Ngoài ra, kết quả của nghiên cứu cũng có thể là cơ sở phục vụ cho các nghiên cứu chọn tạo giống tỏi Lý Sơn.. - Vật liệu nghiên cứu là các củ tỏi được thu thập trực tiếp từ các vùng chuyên canh gồm có tỏi Lý Sơn - Quảng Ngãi (Tọa độ: N15 o E 109 o 6’38.5596. - Ngoài ra, trong nghiên cứu còn sử dụng các loại tỏi Hải Dương, tỏi Trung Quốc được thu thập từ siêu thị Mega market Đà Nẵng có nguồn gốc rõ ràng. - 35 củ đại diện để tiến hành đánh giá đặc điểm hình thái và di truyền bằng chỉ thị phân tử.. - 2.2.1 Đánh giá đặc điểm hình thái củ tỏi Các tính trạng hình thái bên ngoài củ tỏi được quan sát bao gồm màu sắc vỏ lụa, hình dạng đáy củ, kích thước đường kính củ (ĐKC), đường kính vùng rễ (ĐKVR), tỷ lệ ĐKC/ĐKVR (Hồ Huy Cường, 2009. - 2.2.2 Đánh giá đặc điểm di truyền các giống tỏi bằng chỉ thị phân tử. - Sau đó được trộn lại và tạo thành một hỗn hợp DNA đại diện cho từng loại tỏi theo phương pháp BSA (Bulked segregant analysis) (Michelmore et al., 1991).. - Số liệu nghiên cứu hình thái củ tỏi được xử lý bằng phần mềm IBM Statistics SPSS 22. - Kết quả phân tích các loại tỏi bằng chỉ thị SSR được xử lý bằng phần mềm NTSYS_PC version 2.1 với hệ số là NEI72, phương pháp clustering SAHN để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu tỏi (Rohlf, 2000). - Trong đó, n là số lượng allen của chỉ thị i, P ij là tần số của allen j đối với chỉ thị i.. - 3.1 Đặc điểm hình thái củ của các loại tỏi 3.1.1 Màu sắc vỏ lụa. - Kết quả đánh giá màu sắc vỏ lụa củ bên ngoài cho phép chia các loại tỏi thành ba nhóm. - Nhóm thứ nhất có màu sắc vỏ lụa bên ngoài màu trắng, gồm tỏi Lý Sơn, tỏi Khánh Hòa, tỏi Phan Rang. - Hình 1: Màu sắc vỏ lụa của các loại củ tỏi 3.1.2 Đường kính củ và đường kính vùng rễ. - Tính trạng này cho phép phân biệt được rõ ràng 3 loại tỏi Lý Sơn, Khánh Hòa và Phan Rang. - Trong đó, tỏi Lý Sơn có đường kính củ cm), nhỏ hơn tỏi Khánh Hòa cm) và tỏi Phan Rang (3,81. - Ngoài ra, kết quả đánh giá đường kính vùng rễ của các loại tỏi cũng cho thấy tính trạng này có thể được sử dụng để định danh tỏi Lý Sơn với các loại tỏi khác, đặc biệt là tỏi Khánh Hòa và Phan Rang.. - Tỏi Khánh Hòa có nguồn gốc từ tỏi Lý Sơn, vì vậy, sự khác biệt giữa hai loại tỏi này về kích thước củ có thể giải thích là do sự không đồng nhất của điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu giữa hai vùng này tạo nên.. - Bảng 1: Đặc điểm bên ngoài của các loại củ tỏi Loại tỏi Màu sắc. - Đường kính củ (ĐKC)(cm). - Đường kính vùng rễ (ĐKVR)(cm). - Lý Sơn Trắng Không Bằng 2,79±0,2 a 1,11±0,09 a 2,52±0,16 b. - Điều này kết hợp với các điều kiện canh tác có sử dụng cát san hô làm cho củ tỏi được trồng ở Lý Sơn trở nên săn chắc, hương vị cay nồng (Hồ Huy Cường, 2009). - Hòa được đảm bảo hơn, củ tỏi phát triển tốt hơn về kích thước, nhưng hương vị tỏi ở đây nhạt hơn và nhiều nước hơn tỏi Lý Sơn. - Tuy có sự khác biệt về đường kính củ và rễ, nhưng tỷ lệ đường kính củ/đường kính rễ không cho thấy sự khác biệt giữa các loại tỏi Việt Nam. - Như vậy, việc sử dụng các đặc điểm đường kính củ và đường kính vùng rễ cho phép phân biệt tỏi Lý Sơn với những loại tỏi khác, bao gồm tỏi Khánh Hòa.. - Về hình dạng đáy củ, các loại tỏi được chia thành hai nhóm, nhóm đáy lồi gồm tỏi Hải Dương và Lâm Đồng, nhóm đáy bằng gồm 4 loại tỏi Lý Sơn, Khánh Hòa, Phan Rang, Trung Quốc. - Kết quả phân chia này cũng tương đồng với phân tích màu sắc từ vỏ lụa bên ngoài củ tỏi.. - 3.1.4 Đặc điểm tép tỏi. - Kết quả đánh giá số lượng tép trong 1 củ tỏi cho thấy, so với tỏi Khánh Hòa và Phan Rang, tỏi Lý Sơn có số lượng tép ít hơn với tép (Bảng 2). - Số lượng tép của tỏi Hải Dương và Lâm đồng tương đồng với tỏi Lý Sơn. - Kết quả này tương tự như một số nghiên cứu trong nước trước đây về số lượng tép của tỏi Lý Sơn (Hồ Huy Cường, 2009).. - Các loại tỏi Phan Rang, Lý Sơn và Khánh Hòa có cùng số lớp tép của củ. - Các loại củ tỏi này cấu tạo từ 2 lớp tép, lớp bên ngoài gồm các tép to đều,. - Ngoài ra, giữa 2 nhóm tỏi cũng có sự khác biệt về màu sắc vỏ lụa của tép tỏi, màu sắc vỏ lụa củ tỏi.. - 3.1.5 Mặt cắt ngang củ tỏi. - Theo hệ thống phân loại tỏi, khi quan sát mặt cắt ngang của củ tỏi và sự có mặt của thân gỗ cứng nằm ở trung tâm củ, có thể chia các loại tỏi thành hai nhóm chính: Allium sativum var sativum (tỏi mềm - Softneck) và Allium sativum var ophioscorodon (tỏi cứng - Hardneck) (Maab and Klaas, 1995). - Theo kết quả nghiên cứu, hai loại tỏi Hải Dương và Lâm Đồng thuộc nhóm tỏi cứng còn tỏi Trung Quốc, Lý Sơn, Khánh Hòa và Phan Rang thộc nhóm tỏi mềm.. - Theo nghiên cứu của Lee và các cộng tác viên, trong các loại tỏi cứng chứa hàm lượng methiin, alliin và tổng lượng axid amin tự do lớn hơn so với tỏi mềm (Lee et al., 2005).. - Về hình dạng mặt cắt ngang, tỏi Lý Sơn, Khánh Hòa, Phan Rang, Trung Quốc có hình tròn, tỏi Hải Dương và Lâm Đồng là hình ô van. - Căn cứ vào mặt cắt ngang khả năng tách các tép tỏi khỏi củ tỏi, tất các các loại tỏi Việt Nam trong nghiên cứu này đều có kết cấu chặt (khó tách), chỉ riêng tỏi Trung Quốc là tương đối dễ tách hơn.. - Bảng 2: Đặc điểm cấu trúc bên trong của các loại củ tỏi Loại tỏi Màu vỏ tép Thân gỗ cứng. - Lý Sơn Trắng Không tròn 19,8 b ±3,7 2 Chặt. - Hình 2: Màu sắc vỏ tép và mặt cắt ngang của củ các loại củ tỏi. - 3.2 Định danh bằng chỉ thị phân tử 3.2.1 Thiết kế đoạn mồi cpSSR và cpSTR Kết quả phân tích và chọn lọc các trình tự lặp lại đơn trên hệ gen lục lạp KX683282 của tỏi (Allium sativum L.) bằng phần mềm SSRIT cho thấy trong tổng số 153172 nucleotid có 18 trình tự lặp lại 2 nucleotide và không có trình tự lặp lại 3 nucleotide với số lần lặp lại tối thiểu 5 lần. - Từ những trình tự này, đã thiết kế được 2 chỉ thị SSR được sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 3). - Phần mềm TRF cho phép nhận diện được 38 trình tự lặp lại liền kề với độ dài dao động từ 13 - 30 nucleotide và thiết kế được 3 chỉ thị cpSTR phục vụ cho nghiên cứu. - 3.2.2 Phân tích tính đa hình bằng các chỉ thị phân tử. - Kết quả phân tích các mẫu tỏi bằng các chỉ thị phân tử thiết kế được cho thấy, tất cả các chỉ thị là đa hình, tổng số có 15 allen đa hình và không có allen đơn hình đối với 6 loại tỏi. - Trong đó, chỉ thị cpSSR2 thể hiện tính đa hình cao nhất với 5 allen, chiếm 33,33% tổng số allen đa hình. - chỉ thị cpSTR2 và cpSSR1 có tính đa hình thấp nhất là 2 allen chiếm tỉ lệ 13,33%.. - Giá trị PIC thể hiện tính đa dạng di truyền của các alen trên từng locus, khi giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình càng cao và ngược lại, đồng thời tương ứng với khả năng ứng dụng của chỉ thị phân tử trong đánh giá tính đa dạng di truyền (Chen et al., 2014).. - Chỉ thị cpSSR2 có giá trị PIC cao nhất là 0,956 và chỉ thị cpSSR1 và cpSTR2 có giá trị PIC thấp nhấp đạt 0,722. - Các kết quả này cao hơn so với các kết quả đã được công bố trước đây, cụ thể Chen và cộng tác viên (2014) khi nghiên cứu các các chỉ thị SSR và ISSR trên tỏi đã thu được giá trị PIC dao động từ . - đối với nghiên cứu của Cunha và cộng tác viên (2012), giá trị này chỉ đạt . - PIC của các chỉ thị cpSSR và cpSTR trong nghiên cứu này đạt giá trị cao và khẳng định hiệu quả của chúng trong đánh giá tính đa dạng di truyền các loài tỏi.. - Kết quả xử lý bằng phần mềm NTSYS_PC version 2.1 cho phép xác định hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các loại tỏi (Hình 3).. - Chỉ thị phân tử Trình tự đoạn mồi (5’-3’) Nhiệt độ bắt cặp (°C). - Trong đó, mẫu tỏi Lý Sơn và Khánh Hòa có hệ số tương đồng tuyệt đối 1,0, điều này đã khẳng định hai giống tỏi có chung một nguồn gốc xuất xứ. - Tỏi Hải Dương và Đà Lạt - Lâm Đồng được tách ra một nhóm riêng với hệ số di truyền giữa 2 loại tỏi này là 0,733. - Kết quả phân chia các loại tỏi theo chỉ thị phân tử thành 2 nhóm lớn (nhóm 1 – Lâm Đồng, Hải Dương. - và nhóm 2 – Lý Sơn, Khánh Hòa, Phan Rang, Trung Quốc) phù hợp với các nhóm tỏi cứng và tỏi mềm dựa trên sự tồn tại của thân trụ đỗ ở giữa củ tỏi (Maab and Klaas, 1995).. - Như vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử chỉ có thể cho phép phân biệt tỏi Lý Sơn với tỏi Phan Rang, Lâm Đồng, Trung Quốc và Hải Dương. - Hai loại tỏi Lý Sơn và Khánh Hòa không có sự khác biệt về mặt di truyền, vì vậy công cụ sinh học phân tử không thể sử dụng để phân biệt hai loại tỏi này.. - Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra được mối quan hệ di truyền dựa trên chỉ thị cpSSR và cpSTR giữa các loại tỏi, và mô tả một số đặc điểm hình thái củ của tỏi Lý Sơn cũng như các loại mẫu tỏi khác được thu thập: tỏi Khánh Hòa, Phan Rang, Lâm Đồng, Hải Dương, Trung Quốc.. - Phân biệt tỏi Lý Sơn với tỏi Lâm Đồng và tỏi Hải Dương có thể được tiến hành một cách dễ dàng thông qua màu sắc vỏ lụa bên ngoài của củ tỏi.. - Tỏi Lý Sơn được nhận diện khác với tỏi Trung Quốc bởi sự kết hợp giữa đường kính củ, và màu sắc vỏ lụa, màu tép tỏi và số lớp tép tỏi. - Đường kính củ của tỏi Lý Sơn nhỏ hơn của tỏi Trung Quốc, màu tép của tỏi Lý Sơn là màu trắng, trong khi đó màu tép tỏi Trung quốc là màu tím.. - Định danh tỏi Lý Sơn gặp khó khăn, khi so sánh với tỏi Phan Rang và Khánh Hòa, vì những loại tỏi này có rất nhiều đặc điểm hình thái giống nhau như màu sắc vỏ lụa, hình dạng đáy củ, độ chặt của tép, số lớp tép tỏi. - Tuy nhiên, một số đặc điểm về kích thước củ tỏi Lý Sơn như đường kính củ cm), đường kính vùng rễ cm), số lượng tép cm) có giá trị thấp hơn so với tỏi Khánh Hòa và Phan Rang.. - Các chỉ thị cpSSR và cpSTR được thiết kế trong nghiên cứu chỉ cho phép phân biệt tỏi Lý Sơn với tỏi. - Phan Rang, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Trung Quốc.. - Phân tích dữ liệu nghiên cứu với SPSS Tập 2.. - Nghiên cứu phục tráng giống tỏi ở Lý Sơn