- ĐỊNH DANH XẠ KHUẨN CÓ TRIỂN VỌNG. - đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, đặc điểm sinh hóa, định danh, Xạ khuẩn Keywords:. - Mục tiêu của nghiên cứu nhằm xác định đến loài các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh cháy bìa lá lúa, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo góp phần ứng dụng xạ khuẩn vào biện pháp phòng trừ sinh học đối với bệnh cháy bìa lá lúa. - Tám chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - Bằng phương pháp khảo sát đặc điểm nuôi cấy, hình thái và sinh lý cũng như phương pháp phân tích trình tự gen 16S-rRNA và so sánh với bộ gen của các loài vi khuẩn trên GenBank đã xác định được: Chủng CT1 có mức tương đồng với loài Streptomyces kanamyceticus, là 99%. - chủng CT5 có mức tương đồng với loài Streptomyces willmorei là 99%, chủng HG37 có mức tương đồng với loài Streptomyces bacillaris là 100%, chủng ST10 và ST12 có mức tương đồng với loài Streptomyces campoamus là 98%, chủng VL4 có mức tương đồng với loài Streptomyces lipmanii là 100%, chủng VL10 có mức tương đồng với loài Streptomyces bikiniensis là 99%, chủng VL9 có mức tương đồng với loài Streptomyces ostreogriseus là 99%.. - Hiện nay, người nông dân thường sử dụng các biện pháp phòng trị là thuốc hóa học nhưng không có hiệu quả cao mà còn ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con người (Tuzun và Kloepper, 1995). - Trong nhóm vi sinh vật có lợi thì xạ khuẩn là một nhóm có triển vọng với những đặc điểm nổi bật như có khả năng tiết ra nhiều chất kháng sinh (streptomycin, validamycin, kasugamycin, gentamycin…) và các enzyme ngoại bào (chitinase, glucanase, protease, lipase…) để chống lại các tác nhân gây hại cây trồng (Doumbou et al., 2001). - Hiện nay, 80 % chất kháng sinh hiện có đều được sản xuất từ Streptomyces, một chi quan trọng của xạ khuẩn (Watve et al., 2001).. - (2012) xạ khuẩn không những có khả năng đối kháng lại với tác nhân gây bệnh trên lúa mà còn có khả năng kích thích tăng trưởng giúp tăng chiều cao cây lúa. - Ngày nay, vai trò của xạ khuẩn trong việc phòng trị bệnh cây trồng ngày càng được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng nhiều. - Theo kết quả nghiên cứu của Lê Minh Tường (2014), đã tìm ra 8 chủng xạ khuẩn thí nghiệm có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: (1) Định danh đến loài xạ khuẩn bằng phương pháp truyền thống như khảo sát đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý và (2) phương pháp sinh học phân tử dựa vào trình tự gene vùng 16S-rRNA.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu. - Tám chủng xạ khuẩn thí nghiệm có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.. - Kết quả thí nghiệm cho thấy khả. - năng đối kháng của 8 chủng xạ khuẩn thí nghiệm thể hiện qua bán kính vòng vô khuẩn từ 2,18 mm đến 4,20 mm.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát đặc tính hình thái. - Thí nghiệm 1 Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất và sắc tố tan. - Mục tiêu: Ghi nhận màu sắc các chủng xạ khuẩn trên nhiều loại môi trường nuôi cấy khác nhau.. - Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Shirling và Gottlieb (1966).. - Thí nghiệm 2 Quan sát cuống sinh bào tử và hình dạng bề mặt bào tử. - Mục tiêu: Quan sát và ghi nhận hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của tám chủng xạ khuẩn. - Thí nghiệm 3 Khảo sát khả năng tiết enzym protease của các chủng xạ khuẩn. - Mục tiêu: Nhằm xác định khả năng tiết enzym protease của các chủng xạ khuẩn triển vọng.. - Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Mitra và Chakrabartty (2005).. - Thí nghiệm 4 Khảo sát khả năng tiết enzym lipase của các chủng xạ khuẩn. - Mục tiêu: Nhằm xác định khả năng tiết enzym lipase của tám chủng xạ khuẩn.. - Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của (Ertuğrul et al., 2007). - Thí nghiệm 5 Khảo sát khả năng tiết enzym amylase của các chủng xạ khuẩn. - Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Santos (2012).. - Thí nghiệm 6 Khảo sát sự hình thành sắc tố melanin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng. - Mục tiêu: Nhằm xác định khả năng tiết melanin của các chủng xạ khuẩn triển vọng. - Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Shirling and Gottlieb, 1966.. - 2.2.3 Thí nghiệm 7 Định danh đến loài các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử. - Tách chiết DNA của các chủng xạ khuẩn Chọn 10 khuẩn lạc ròng, cho vào tube 2,2 ml (ưu tiên chọn những khuẩn lạc lẻ, rời). - Khuếch đại đoạn gen 16S-rRNA của các chủng xạ khuẩn với cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu là (Weisburg et al., 1991):. - 0,25 µl mồi 1492R và 2 µl DNA của xạ khuẩn.. - Phản ứng PCR: hỗn hợp PCR của mỗi chủng xạ khuẩn sau khi pha xong sẽ được cho vào máy PCR với chu kì nhiệt bắt đầu bằng giai đoạn biến tính DNA ở 95 o C trong 5 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ lặp lại của giai đoạn biến tính ở 95 o C trong 1 phút, giai đoạn bắt cặp ở 53 o C trong 30 giây và giai đoạn kéo dài ở 72 o C trong 90 giây. - Một lượng 7 µl sản phẩm PCR của mỗi chủng xạ khuẩn được nhuộm với 5 µl thuốc nhuộm và được cho vào các giếng nhỏ. - Sau đó, gel được điện di trong môi trường TBE 1X ở 100V trong thời gian 60 phút.. - Phân tích kết quả bằng phần mềm sequecing analysis 5.3, và so sánh với kết quả trên ngân hàng gen để xác định tên của xạ khuẩn.. - 3.1 Định danh xạ khuẩn dựa vào đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý. - Kết quả về đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý của 8 chủng xạ khuẩn thí nghiệm được trình bày ở Bảng 1.. - Chủng CT1 có chuỗi bào tử dạng thẳng (R), bề mặt bào tử dạng trơn, chủng này có màu trắng trên môi trường nuôi cấy. - Chủng CT1 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy và không có khả năng sinh melanin. - Bên cạnh đó, dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn CT1 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase.. - Chủng CT5 có chuỗi bào tử dạng thẳng và hơi gơ ̣n sóng (RF), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu trắng. - Chủng CT5 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy và không có khả năng sinh melanin. - Bên cạnh đó, dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn CT5 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase.. - Bảng 1: Đặc điểm về hình thái, nuôi cấy và đặc điểm sinh lý-sinh hóa của tám chủng xạ khuẩn thí nghiệm. - Đặc điểm Chủng xạ khuẩn thí nghiệm. - bào tử Thẳng (R) Thẳng-Rợn. - Bề mặt bào tử Trơn Trơn Trơn Trơn Trơn Trơn Trơn Trơn. - Chủng HG37 có chuỗi bào tử dạng thẳng và hơi gơ ̣n sóng (RF), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu xám nâu. - Chủng HG37 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy tuy nhiên có khả năng sinh sắc tố melanin (màu nâu vàng). - Bên cạnh đó, dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn HG37 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase.. - Chủng ST10 có chuỗi bào tử dạng móc câu (RA), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu xám. - Chủng ST10 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy và có sinh sắc tố melanin (nâu vàng). - Ngoài ra, dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn ST10 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase.. - Chủng VL4 có chuỗi bào tử dạng thẳng và hơi gơ ̣n sóng (RF), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu trắng. - Chủng VL4 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy và không có khả năng sinh melanin. - Thêm vào đó, dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn VL4 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase.. - Chủng ST12 có chuỗi bào tử dạng móc câu (RA), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu xám. - Chủng ST12 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy và có sinh sắc tố melanin (nâu vàng). - Dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn ST12 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase.. - Hình 1: Hình dạng cuống sinh bào tử dạng rợn sóng (A) và bề mặt bào tử trơn (B) được quan sát dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển điện tử (B). - Chuỗi bào tử. - Hình 2: Khả năng tạo sắc tố melanin (A) và không tạo sắc tố melanin (B) trên môi trường nuôi cấy ISP6 của xạ khuẩn ở 4 NSKC. - Chủng VL10 có chuỗi bào tử dạng thẳng và hơi gơ ̣n sóng (RF), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu xám nâu. - Chủng VL10 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy đồng thời chủng này có sinh sắc tố melanin (nâu đen). - Bên cạnh đó dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn VL10 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase.. - Chủng VL9 có chuỗi bào tử dạng thẳng và hơi gơ ̣n sóng (RF), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu xám. - Chủng VL9 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy đồng thời chủng này có sinh sắc tố melanin trên môi trường nuôi cấy (nâu vàng). - Bên cạnh đó dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn VL9 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các. - Sau khi tiến hành so sánh các đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý - hóa với khoa phân loại xạ khuẩn của International Streptomyce Project (Shirling và Gottlieb, 1972. - Waksman, 1961) ta có thể xếp 8 chủng xạ khuẩn : CT1, CT5, HG37, ST10, VL4, ST12, VL10, VL9 vào chi Streptomyces.. - Để có thể xác định chính xác đến tên loài của các chủng xạ khuẩn trên cần phải kết hợp các đặc điểm phân loại theo phương pháp truyền thống với việc xác định bằng phương pháp sinh học phân tử.. - 3.2 Định danh các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử. - Tám chủng xạ khuẩn được ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCR với đoạn mồi thuộc vùng 16S-rRNA. - Kết quả cho thấy tám chủng xạ khuẩn có trọng lượng phân tử khoảng 1500 bp (Hình 3), phù hợp với trọng lượng phân tử các chủng xạ khuẩn thuộc loài Streptomyces.. - Hình 3: Sản phẩm PCR được khuếch đại với đoạn mồi thuộc vùng 16S-rRNA của 8 chủng xạ khuẩn nghiên cứu. - Dựa vào kết quả Bảng 2 cho thấy các chủng xạ. - khuẩn thí nghiệm có mức độ tương đồng từ 98 – 100% khi so sánh với loài chuẩn dựa vào trình tự gen vùng 16S rRNA. - tương đồng với loài Streptomyces kanamyceticus là 99%. - chủng CT5 có mức tương đồng với loài Streptomyces willmorei là 99%, chủng HG37 có mức tương đồng với loài loài Streptomyces bacillaris là 100%, 2 chủng ST10 và ST12 có mức tương đồng với loài Streptomyces campoamus là. - 98%, chủng VL4 có mức tương đồng với loài Streptomyces lipmanii là 100%, chủng VL10 có mức tương đồng với loài Streptomyces bikiniensis là 99% và chủng VL9 có mức tương đồng với loài Streptomyces ostreogriseus là 99%. - Bảng 2: Mức độ tương đồng. - trình tự gene của 8 chủng xạ khuẩn thí nghiệm với trình tự gene của các chủng xạ khuẩn có sẵn trên ngân hàng gene dựa vào trình tự gen vùng 16S-rRNA. - Chủng xạ khuẩn Xác định loài trên ngân hàng gen Mức độ tương đồng. - Mặt khác, kết quả trình bày ở cây phả hệ (Hình 4) cho thấy, khả năng phân nhóm của các chủng xạ khuẩn thí nghiệm rất rỏ ràng phân theo vùng địa lý và chia thành 2 nhóm lớn. - Nhóm I gồm 4 chủng xạ khuẩn và chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm IA gồm 2 chủng xạ khuẩn CT1 và CT5 có nguồn gốc từ thành phố Cần Thơ và mức độ tương đồng của chúng là 99%. - ST10 có nguồn gốc từ tỉnh Sóc Trăng và mức độ tương đồng của chúng là 100%. - Nhóm II gồm 4 chủng xạ khuẩn và chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm IIA gồm chủng HG37 có nguồn gốc từ tỉnh Hậu Giang và nhóm IIB gồm 3 chủng VL10. - VL9 và VL4 có nguồn gốc từ tỉnh Vĩnh Long và mức độ tương đồng của chúng là 98%.. - Hình 4: Cây phả hệ của 8 chủng xạ khuẩn có khả năng phòng trị bệnh cháy bìa lá lúa dựa vào trình tự gen vùng 16S-rRNA. - Tám chủng xạ khuẩn nghiên cứu thuộc loài Streptomyces kanamyceticus, loài Streptomyces willmorei, loài Streptomyces bacillaris, loài Streptomyces capoamus, loài Streptomyces lipmanii, loài Streptomyces capoamus, loài Streptomyces bikiniensis và loài Streptomyces ostreogriseus.. - Tuyển chọn xạ khuẩn Actinomycetes sp. - có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.