- THANH LỌC VÀ PHÂN TÍCH DI TRUYỀN CÁC GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY NÂU (NILAPARVATA LUGENS STAL.). - Nghiên cứu đánh giá tính kháng rầy nâu của 100 giống lúa ở Thành phố Cần Thơ và ứng dụng marker phân tử trong phân tích DNA để xác định gen kháng rầy nâu. - Các giống lúa lọc ra từ Ngân hàng gen cây lúa của Viện Nghiên cứu &. - Phát triển Đồng bằng Sông Cửu Long được thử nghiệm cùng với giống chuẩn nhiễm TN1 và giống chuẩn kháng PTB33 tiến hành đánh giá tính chống chịu rầy nâu trong nhà lưới bằng phương pháp hộp mạ của IRRI có cải tiến, theo thang điểm 9 cấp (IRRI, 2002). - Kết quả xác định 8 giống hơi kháng (cấp 3), 43 giống hơi nhiễm (cấp 5), 39 giống nhiễm (cấp 7) và 10 giống rất nhiễm (cấp 9). - Từ kết quả thanh lọc trong nhà lưới chọn 43 giống lúa để kiểm tra sự hiện diện gen kháng rầy nâu bằng cặp mồi (primer) RG457FL/RL liên kết chặt chẽ với gen Bph-10 (theo công bố của IRRI), sản phẩm PCR, sau đó, được cắt bằng enzyme cắt giới hạn HinfI để tìm ra sự đa hình về kiểu gen của các giống lúa thực nghiệm. - Kết quả cuối cùng cho thấy, có 4 giống mang kiểu gen dị hợp tử kháng, 7 giống đồng hợp tử (gồm cả giống đối chứng PTB33), 34 giống còn lại không mang gen kháng. - Như vậy, qua kết quả thanh lọc hộp mạ và marker phân tử đã xác định được 10 giống mang gen kháng rầy nâu Bph-10.. - Từ khóa: Rầy nâu, Bph-10, giống kháng, đồng hợp tử, dị hợp tử. - 1 Viện Nghiên cứu và Phát triển CNSH, Trường Đại học Cần Thơ. - 2 Viện Nghiên cứu phát triển ĐBSCL, Trường Đại học Cần Thơ. - Ở Việt Nam có thể nói lúa gạo là cây lương thực chính đóng vai trò quan trọng trong đời sống và phát triển kinh tế xã hội, đặc biệt là ở nông thôn. - Sản phẩm lúa gạo xuất khẩu của Việt Nam đứng hàng thứ hai trên thế giới nhiều năm liền, trong đó đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) được xem là vựa lúa lớn nhất nước. - Tuy nhiên, nghề trồng lúa luôn gặp phải những trở ngại và thách thức, do điều kiện thâm canh hiện nay với các giống lúa mới cao sản ngắn ngày, khi bón phân đạm kết hợp với khí hậu gió mùa nóng ẩm quanh năm sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho dịch hại phát triển.. - Rầy nâu là côn trùng gây hại lớn nhất đối với cây lúa ở nước ta cũng như các nước trồng lúa ở Châu Á. - Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng nhưng diện tích đất lại thu hẹp, nông dân buộc phải tăng vụ và thực hiện thâm canh cũng như sử dụng kém đa dạng, chỉ một số giống lúa thích nghi cho năng suất, hiệu quả kinh tế cao là được ưa chuộng. - Vì vậy, phòng trừ rầy nâu cần kết hợp nhiều biện pháp như giống kháng, kỹ thuật canh tác, phòng trừ sinh học và hóa học. - Đã có nhiều nghiên cứu về các giống lúa kháng rầy trên thế giới chủ yếu dựa vào các kỹ thuật sinh học phân tử như SSR (Simple Sequence Repeats), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism), STS (Sequence Tagged Sites) làm cơ sở cho việc phân lập các hệ gen kháng rầy. - Trong đó dấu STS tỏ ra hữu hiệu trong việc xác định gen kháng rầy trên lúa, đặc biệt là gen Bph-10, gen kháng quần thể rầy nâu loại hình sinh học 2 và 3 (Nguyễn Thị Lang et al., 2006). - Trong bài báo này, chúng tôi t hanh lọc các giống lúa kháng rầy ở thành phố Cần Thơ nhằm đánh giá khả năng kháng của các gen kháng, phục vụ cho công tác chọn giống.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm. - giống lúa mùa làm thức ăn cho rầy. - Giống lúa: 100 giống lúa (Bảng 1) được cung cấp từ Ngân hàng Gen, Viện Nghiên cứu Phát triển ĐBSCL - Trường Đại học Cần Thơ. - Bảng 1: Danh sách các giống lúa. - 35 Một bụi vàng 1 35 87 Trắng ngọc nữ 87. - 2.2.1 Phương pháp đánh giá kiểu hình. - Chuẩn bị lúa cho rầy ăn: Lúa Tài Nguyên mùa được 10 ngày tuổi thì bón phân theo công thức 200kg N (hòa nước tưới) để cho cây lúa phát triển nhanh và tốt, khi lúa được khoảng 25-30 ngày tuổi có thể dùng cho rầy ăn.. - Nuôi rầy: Rầy nâu trưởng thành được bắt đem về nuôi trong lồng lưới để sinh ấu trùng và khi trứng nở thành rầy cám 1-2 tuổi, đồng thời với lúa ở giai đoạn 2 lá mầm (cao khoảng 2,0 cm).. - Giống lúa: Sử dụng giống chuẩn kháng (PTB33) và giống chuẩn nhiễm (TN1) làm đối chứng và các giống lúa muốn thử tính kháng rầy. - Tiến hành đánh giá theo phương pháp đánh giá hộp mạ của IRRI có cải tiến. - Khay bùn được đậy kín để giúp mầm lúa phát triển đều đạt chiều cao 2,0 cm. - Khi mạ được 2-3 lá mầm (khoảng 7-10 ngày sau gieo) tiến hành thả rầy 1-2 tuổi với mật độ 4-6 con/cây và theo dõi đánh giá.. - Khi tất cả những cây của giống chuẩn nhiễm (TN1) vừa chết hết do rầy gây hại, tiến hành đánh giá tính kháng của các giống thử nghiệm.. - Đánh giá sự gây hại của rầy nâu theo thang điểm chín cấp của IRRI (1996).. - 2.2.2 Phương pháp đánh giá kiểu gen Ly trích DNA. - Sau khi có kết quả thanh lọc kiểu hình các giống lúa, tiến hành xác định kiểu gen.. - Thu lấy lá non của các giống lúa, cắt lá lúa và cho vào các tuýp với lượng khoảng 0,1g/tuýp. - DNA được kiểm tra trên gel agarose 0,8% với sự hiện diện của ethidium bromide (EtBr), điện di ở hiệu điện thế 100V trong 15 phút (5Volt/cm) để kiểm tra sản phẩm đã ly trích. - Phản ứng PCR (DNA STS). - Các sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5%, với sự hiện diện của ethidium bromide 2,0 l/100 ml với hiệu điện thế 50Volt trong 35 phút (5Volt/cm) trong dung dịch TE 1X. - Sản phẩm PCR (DNA STS) được cắt bằng enzyme HinfI với công thức được thể hiện như sau: 8µl DNA STS, 3µl enzyme HinfI 10U/µl (Invitrogen), 2µl RC buffer (50mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol, 500µg/ml BSA, 50% (v/v) glycerol), thêm BiH 2 O vào cho đủ thể tích 20µl, rồi đem ủ ở 37 o C trong 16 giờ.. - Kiểm tra sản phẩm cắt enzyme bằng gel agarose 2,0%.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Đánh giá tính kháng rầy bằng phương pháp hộp mạ theo SES (IRRI, 1996). - Tổng hợp kết quả đánh giá kiểu hình 100 giống lúa. - Cấp 0 (Rất kháng): Cây phát triển bình thường, không bị hại.. - Cấp 5 (Nhiễm vừa): Vàng và lùn rõ rệt, 10-25 % số cây đang héo hay chết, những cây còn lại còi cọc và kém phát triển.. - Từ kết quả thanh lọc kiểu hình của 100 giống lúa trên, ta chọn ra được 43 giống thích hợp (các giống đều có cấp độ kháng từ cấp 5 trở xuống) để tiến hành ly trích DNA và đánh giá kiểu gen kháng rầy trên các giống này bằng marker phân tử.. - 3.2 Kết quả đánh giá kiểu gen bằng sinh học phân tử. - Các mẫu DNA sau khi ly trích được kiểm tra trên gel agarose 0.8%, các mẫu DNA đều cho một vạch sáng rõ, không bị gãy, các mẫu DNA này sẽ được lưu trữ cho các bước thí nghiệm tiếp theo.. - MỨC ĐỘ KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG K KV NV N NN. - 3.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR. - Hình 2: Phổ diện điện di sản phẩm PCR với cặp mồi RG457FL/RL M: ladder 100bp DNA, số ký hiệu tại các giếng là số kí hiệu mẫu. - Kết quả PCR trên gel agarose 1,5% với M là thang chuẩn 100 bp, ta thấy các giống lúa (tương ứng với các số trên giếng) đều tạo ra một băng sáng có kích thước tương đương khoảng 750-800 bp (Hình 2). - Tuy nhiên, kết quả này không thể hiện được sự đa hình giữa các giống lúa, do đó không thể phân biệt được giống kháng rầy nâu và giống nhiễm rầy nâu. - Vì vậy, cần tiến hành cắt sản phẩm PCR với enzyme HinfI để tìm ra sự đa hình giữa các giống lúa.. - 3.2.2 Kết quả cắt bằng enzyme giới hạn HinfI. - Hình 3: Sản phẩm PCR với cặp mồi RG457FL/RL được cắt bằng enzyme HinfI M: Ladder 100 bp, số ký hiệu tại các giếng là số kí hiệu mẫu. - Sau khi kiểm tra và đánh giá sự khác biệt của các băng tạo ra giữa 43 giống lúa trên gel agarose 2%, với TN1 là giống chuẩn nhiễm, các giống lúa còn lại (là số kí hiệu tại các giếng) ta thấy có xuất hiện sự đa hình (Hình 3). - Theo Lang et al.. - (1999) sau khi khuếch đại DNA của các giống lúa với cặp mồi RG457FL/RL, kiểm tra trên gel sẽ xuất hiện các băng có kích thước từ 750-800 bp. - Sau khi cắt với enzyme HinfI, giống mang kiểu gen đồng hợp kháng sẽ có kích thước khoảng 200 bp, 250 bp, 350 bp, giống mang kiểu gen đồng hợp nhiễm có kích thước là 200 bp và 600 bp, đối với những giống mang gen kháng rầy dị hợp tử có kích thước là 200 bp, 250bp, 350 bp và 600 bp.. - Theo kết quả nghiên cứu của Lang et al. - (1999), tiến hành phân loại kiểu gen của các giống lúa dựa vào kết quả kiểm tra trên gel agarose 2% như sau:. - Giống có kiểu gen dị hợp tử kháng với các băng có kích thước lần lượt là 200 bp, 250bp, 350bp và 600bp.. - Giống có kiểu gen đồng hợp tử kháng có kích thước lần lượt là 200bp, 250bp và 350bp.. - Các giống còn lại đều có hai băng rõ nét thể hiện trên hình gel với kích thước khoảng 200bp và 600bp. - Đây đều là các giống không mang gen kháng rầy.. - Từ kết quả đánh giá kiểu hình, so sánh và đối chiếu với kết quả đánh giá kiểu gen chọn lọc được 10 giống (Bảng 2) có mang kiểu gen kháng đối với rầy nâu. - Có thể tiếp tục sử dụng những giống này lai tạo phục vụ cho công tác chọn tạo giống kháng rầy nâu sau này.. - Bảng 2: So sánh kết quả đánh giá kiểu hình và kiểu gen. - TÊN CẤP ĐỘ KHÁNG RẦY KIỂU GEN. - Ngọc nữ đột biến 3. - đồng hợp tử. - dị hợp tử. - Từ kết quả đánh giá kiểu hình và kiểu gen của 10 giống lúa (Bảng 2) ta nhận thấy các giống: OM6073, giống Lùn Trắng Phếu và giống 10 hà cho kết quả đánh giá kiểu hình với cấp độ là 5 (nhiễm vừa) nhưng kết quả đánh giá kiểu gen dựa trên chỉ thị phân tử RG457FL/RL thì cho kết quả là mang gen đồng hợp tử kháng (đối với giống Lùn trắng phếu và giống 10 hà) và dị hợp tử mang gen kháng với rầy nâu (giống OM6073).. - Ishii et al. - (1994) đã thiết lập bản đồ RFLP và xác định gen Bph-10 kháng biotype 2 và 3, định vị trên nhiễm sắc thể 12 liên kết với RG457. - Cặp primer được thiết kế từ RG457 (chỉ thị STS) đã phát hiện được gen kháng rầy nâu Bph-10 với khoảng cách di truyền 1.7cM trên quần thể lúa hoang Oryza australiensis và những dòng con lai có xuất xứ từ loài lúa hoang này (Lang et al., 1999).. - Do vậy, với chỉ thị phân tử RG457Fl/RL chỉ phát hiện được những giống lúa có mang gen Bph-10, kết quả đánh giá kiểu hình thì cho thấy các giống lúa đã bị nhiễm với rầy nâu. - Có thể thấy những giống lúa hiện tại đang được sử dụng để kháng với rầy nâu thì không mang lại kết quả cao, có thể đã xuất hiện loại hình rầy nâu mới ở ĐBSCL không chỉ là loại biotype 2 và 3 như đã được biết trước đây.. - Kết quả nghiên cứu ghi nhận được 10 giống lúa mang gen kháng rầy nâu Bph-10 trong đó: Bốn giống mang gen dị hợp tử kháng: Thơm lùn mùa, Năm tài 2, Thơm mẵn và OM6073, Bảy giống mang gen đồng hợp tử kháng: Lùn trắng phếu, Nếp, 10 Hà, MTL495, Vàng 3 danh, Ngọc nữ đột biến và PTB33 (ĐC).. - Chỉ thị phân tử RG457FL/RL chỉ tỏ ra hữu hiệu trong việc xác định giống lúa mang gen Bph-10 kháng với rầy nâu loại hình sinh học 2 và 3. - hiện nay, thì nòi rầy nâu có thể đã phát sinh những quần thể rầy nâu mới (biotype 1 và 4), do vậy cần có những nghiên cứu trên những chỉ thị phân tử khác để xác định các gen kháng khác trên các giống đối với rầy nâu cũng như tìm hiểu và xác định loại hình rầy nâu mới xuất hiện ở ĐBSCL.. - Ứng dụng STS (Sequence Tagged Sites) và SSR (Simple Sequence Repeats) marker để đánh giá tính chống chịu rầy nâu trên cây lúa Oryza sativa L.. - Tạp chí Nông Nghiệp và phát triển nông thôn, số 4, tr.. - “Đánh giá tính kháng của các tổ hợp lúa năng suất cao, phẩm chất tốt đối với quần thể rầy nâu tại Đồng Bằng Sông Cửu Long 2003-2005”. - Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, kỳ 2, tr