- HIỆU QUẢ CỦA CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRỢ GIÚP CHỌN LỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA. - 1 Viện nghiên cứu &. - Chỉ thị phân tử, đa hình từng nucleotid, độ trở hồ (ĐTH), rầy nâu, tính trạng mùi thơm Keywords:. - Sử dụng chỉ thị hoàn hảo với bốn mồi chuyên biệt trong một phản ứng PCR là rất hữu hiệu để phát hiện nhanh những cá thể thơm đồng hợp, không thơm đồng hợp và không thơm dị hợp trong một quần thể còn đang phân ly về tính trạng mùi thơm ở lúa. - Tương quan giữa chỉ thị này và tính trạng mùi thơm là 100%. - Hai SNP kề cận nhau (GC/TT) của gen SSIIa liên kết gần với độ trở hồ (ĐTH), dựa trên các SNP này, bốn mồi NF1, NR1, F22 và R21 đã được sử dụng trong một phản ứng PCR. - Phân tích sản phẩm PCR cho thấy với 350 bp từ kiểu gen TT có ĐTH thấp, với 550 bp từ kiểu gen GC có ĐTH cao hoặc trung bình. - Tương quan giữa chỉ thị này và ĐTH là 92%. - Chỉ thị S00310 nằm trên tay ngắn nhiễm sắc thể thứ 6 của lúa có liên kết với gen Bph25 đã được sử dụng trong nghiên cứu này để nhận diện tính kháng rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) ở lúa. - Kết quả của các sản phẩm PCR đã cho thấy chỉ thị S00310 liên kết với gen kháng rầy và có tỷ lệ khoảng 92% về sự tương quan giữa chỉ thị này và kiểu hình kháng rầy.. - Trong khi đó chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng mục tiêu gọi tắt là MAS (marker-assisted selection) là một quy trình sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc gián tiếp của một hoặc nhiều yếu tố quyết định di truyền một tính trạng quan trọng, đây là phương pháp được thế giới ủng hộ mạnh mẽ bởi vì kỹ thuật này đã rút ngắn được thời gian lai tạo giống và có thể cho kết quả sau ba thế hệ chọn lọc (Tanksley and Nelson, 1996). - MAS cũng làm tăng hiệu quả của các lựa chọn vì nó có thể được sử dụng trong giai đoạn cây giống, nó cũng phân biệt các đồng hợp tử với dị hợp tử, lựa chọn cho một số đặc tính cùng lúc. - Hiện nay, ở cây lúa có rất nhiều chỉ thị phân tử đã được nhận diện, các chỉ thị này có thể liên quan đến các gen đang được chú ý.. - Chỉ thị phân tử của các trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeat-SSR), cũng được gọi là các vi vệ tinh (microsatellite) là những đoạn ngắn của DNA có chứa từ 2 đến 6 nucleotid có trình tự lặp lại liên tiếp và số các trình tự lặp lại dao động từ 2 đến 40. - Chỉ thị SSR rất phổ biến ở bộ gen thực vật, chúng được phân bố rải rác khắp nơi trong bộ gen và có tính đặc trưng cho từng loài. - Chỉ thị này cũng đã được chứng minh là đa hình trong quần thể lúa (Olufowote et al., 1997). - Việc trình tự bộ gen cây lúa được giải mã càng cho phép chỉ thị SSR có nhiều lựa chọn hơn. - McCouch et al., 2002).. - Chỉ thị phân tử của các trình tự đa hình từng nucleotid (Single Nucleotide Polymorphism-SNP) là sự khác biệt trong trình tự DNA chỉ ở một nucleotid trong bộ gen. - Việc sử dụng thuốc trừ sâu để phòng trị dịch bệnh do rầy nâu không chỉ tốn kém mà còn gây ảnh hưởng xấu đến môi trường. - Ứng dụng các chỉ thị SSR liên kết với các gen kháng rầy để chọn lọc các dòng lúa kháng rầy đang là một xu hướng nghiên cứu rất được quan tâm trong công tác chọn giống. - Hiện nay, có hơn 25 gen kháng rầy nâu đã được lập bản đồ trên các nhiễm sắc thể, nhận diện các chỉ thị SSR nào có liên kết chặt với gen kháng rầy có ý nghĩa rất quan trọng đối với các nhà chọn giống.. - Waters et al., 2006. - Mùi thơm của gạo cũng là một trong những đặc điểm thu hút người tiêu dùng. - Một vài phương pháp đánh giá cảm quan đã được phát triển nhằm giúp các nhà tạo giống lựa chọn lúa thơm nhưng họ gặp phải nhiều hạn chế khi thực hiện với số lượng mẫu lớn, tiêu tốn nhiều nhân lực, khó khăn và độ tin cậy không cao. - Phương pháp sắc ký khí để xác định hợp chất tạo mùi thơm ở lúa 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) một cách khách quan đã được phát triển nhưng cần một lượng lớn mẫu và tiêu tốn nhiều thời gian. - Các chỉ thị phân tử mới hiện nay như là SNP và SSR có liên kết di truyền với tính trạng mùi thơm đã được phát triển nhằm chọn lọc lúa thơm. - Mặc dù, các chỉ thị phân tử này có ưu điểm rẻ tiền, đơn giản, nhanh chóng và chỉ cần một lượng nhỏ mô mẫu, nhưng chúng chỉ liên kết với gen mùi thơm (fgr), do đó chúng không thể dự đoán tính trạng mùi thơm với độ chính xác 100%. - Một chỉ thị phân tử hoàn hảo là chỉ thị phân tử nằm trong gen mã hóa cho tính trạng. - Các kỹ thuật viên ở trường Đại học Southern Cross đã phát hiện ra đột biến mất một đoạn 8 cặp nucleotid và 3 SNP trong một gen được cho là mã hóa enzyme betaine aldehyde dehydrogenase 2 (BADH2) là tác nhân tạo ra mùi thơm ở gạo Jasmine và Basmati.. - Các giống lúa không thơm sở hữu một phiên bản. - Sự đa hình này đem đến cơ hội để xây dựng một chỉ thị phân tử hoàn hảo cho việc nghiên cứu gen thơm trên lúa. - Bradbury et al. - 2005a) đã sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại chuyên biệt alen này với 4 cặp mồi: ESP, EAP, IFAP và INSP giúp phân biệt kiểu gen của các giống lúa thơm đồng hợp tử và dị hợp tử.. - Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả của việc sử dụng các chỉ thị phân tử thông qua việc đánh giá mối tương quan giữa chỉ thị phân tử với tính trạng mà nó có thể liên kết nhằm giúp cho công tác chọn tạo các đặc tính quan trọng của lúa được thuận tiện và chính xác hơn.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu. - Tổng cộng có 25 giống/dòng lúa được sử dụng trong nghiên cứu này, trong đó giống lúa OM6073 được cung cấp từ Viện lúa Ô Môn, các dòng Jasmine85-45, Jasmine85-46, Jasmine85-68 được thu thập từ ruộng lúa lẫn tạp của nông dân tỉnh Đồng Tháp và các giống lúa còn lại được cung cấp từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Đồng bằng Sông Cửu Long, Trường Đại học Cần Thơ.. - 2.2 Phương pháp. - 2.2.1 Xác định mùi thơm bằng dung dịch KOH Áp dụng phương pháp phân tích mùi thơm của hạt gạo bằng dung dịch KOH 1,7% (Sood and Siddiq, 1978). - Sau đó lấy ra ngửi xác định mùi thơm. - Sử dụng giống đối chứng thơm (Jasmine85) và giống đối chứng không thơm (VND95-20). - Mùi thơm của hạt gạo được đánh giá theo ba cấp độ: 0- gạo không thơm, 1- gạo thơm nhẹ và 2- gạo thơm.. - Độ trở hồ (ĐTH) được đánh giá qua độ lan rộng của hạt gạo khi xử lý bằng dung dịch kiềm. - ĐTH được đánh giá theo tiêu chuẩn IRRI (1996).. - 2.2.3 Đánh giá mức độ nhiễm rầy nâu theo phương pháp khai mạ cải tiến của IRRI (1980). - Mỗi giống được gieo thành 3 ô, mỗi ô 30 hột, sau khi lúa mọc tỉa khoảng 25 cây/ô, mạ 7 ngày tuổi tiến hành thả rầy vào mật độ 5-7 con/cây, tiến hành đánh giá ngay khi giống chuẩn nhiễm TN1 bị chết 90%. - Đánh giá phản ứng theo thang 9 cấp của IRRI (1996).. - Bảng 1: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR:. - 6 (Jin et al., 2010). - 0,5% DMSO, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mỗi loại, 200 nM mỗi loại mồi (đối với phản ứng PCR sử dụng 2 cặp mồi. - Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel 1,5% agarose (sản phẩm PCR của chỉ thị S00310 được phân tích trên gel 3%. - Thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas đã được sử dụng để ước lượng kích thước đoạn sản phẩm PCR.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá mùi thơm của lúa bằng. - phương pháp cảm quan và bằng chỉ thị phân tử:. - Đánh giá mùi thơm bằng phương pháp cảm quan:. - Kết quả đánh giá từ Bảng 2 cho thấy có 1 giống có cấp độ 0 (VND95-20).. - 46) và 10 giống lúa còn lại được đánh giá có mùi thơm cấp độ 2.. - Bảng 2: Đánh giá mùi thơm hạt gạo bằng phương pháp cảm quan. - Đánh giá mùi thơm bằng chỉ thị phân tử:. - Hình 1: Sản phẩm PCR với các mồi ESP và IFAP, INSP và EAP. - Đặc biệt nhất là cặp mồi ESP-IFAP sẽ giúp nhận diện được gen thơm nếu sản phẩm PCR có kích thước 257bp và cặp mồi INSP-EAP sẽ giúp nhận diện lúa không thơm khi sản phẩm PCR có kích thước 355bp. - Ngoài ra, nếu trong sản phẩm PCR có cùng lúc hai sản phẩm 257bp và 355bp thì giống lúa đó sẽ mang kiểu gen. - Kết quả phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose (Hình 1) có 1 giống lúa không thơm đồng hợp (VNĐ95-20), 2 dòng lúa thơm dị hợp (Jasmine85-45 và Jasmine85-46) và 10 giống còn lại đều mang gen thơm đồng hợp.. - Sự tương quan của phương pháp đánh giá cảm quan và chỉ thị phân tử trong xác định mùi thơm của lúa. - So sánh phương pháp đánh giá mùi thơm bằng cảm quan và bằng chỉ thị phân tử đã cho thấy có rất nhiều điểm rất tương đồng với nhau như sau: giống lúa VND95-20 đều cho kết quả xác nhận là lúa không thơm bằng hai phương pháp trên, tương tự M . - như vậy 9 giống lúa thuộc bộ giống MTL được đánh giá là thơm cấp độ 2 và cùng có gen thơm đồng hợp giống như giống đối chứng Jasmine85.. - Ngoài ra, cả hai dòng Jasmine85-45 và Jasmine85- 46 được đánh giá cảm quan là có mùi thơm nhẹ thì có kết quả là mang gen dị hợp khi được đánh giá bằng chỉ thị phân tử, kết quả này cũng đã nói lên được rằng cả hai dòng này còn đang phân ly chứ chưa phải là dòng thuần. - Từ những kết quả so sánh này đã cho thấy sự tương quan giữa chỉ thị của gen thơm BADH2 và mùi thơm của hạt gạo là 100%.. - Do đó, nếu sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc giống lúa có mùi thơm là rất hiệu quả vì vừa đơn giản (do thực hiện được tại phòng thí nghiệm), rút ngắn thời gian tuyển chọn (do có thể phân tích khi cây còn ở giai đoạn mạ) mà còn nhận diện được những cá thể nào thuần hay còn đang phân ly trong khi đánh giá cảm quan thì không thể nhận diện được đặc tính này. - 3.2 Đánh giá ĐTH bằng dung dịch KOH 1,7% và bằng chỉ thị phân tử. - Đánh giá ĐTH bằng dung dịch KOH 1,7%. - Kết quả đánh giá (Bảng 3) cho thấy có sáu giống được xếp loại có ĐTH cao (1-3,5) bao gồm giống MTL 495, MTL513, MTL514, MTL559, MTL250 và VND95-20. - Bảng 3: Đánh giá cấp ĐTH bằng dung dịch KOH 1,7% và bằng chỉ thị phân tử SSIIa (dựa trên sản phẩm PCR) của các giống lúa STT Giống/Dòng. - hồ Sản phẩm PCR. - 12 Jasmine bp Đánh giá độ trở hồ bằng chỉ thị phân tử SSIIa:. - Để đánh giá khả năng liên kết của chỉ thị SSIIa với gen qui định tính trạng về ĐTH, nghiên cứu này đã sử dụng bốn mồi: NF1, NR1, F22 và R21.. - Kết hợp giữa kết quả phân tích sản phẩm PCR (Hình 2) với kết quả đánh giá độ trở hồ bằng dung dịch kiềm (Bảng 3) đã cho thấy phương pháp đánh giá bằng chỉ thị SSIIa có thể nhận diện các giống lúa có ĐTH từ cao đến trung bình (1,0-5,0) khi sản phẩm PCR có kính thước 550bp (bao gồm các giống lúa MTL495, MTL513, MTL514, MTL549, MTL559, MTL 579, MTL250 và VND 95-20) trong khi giống MTL555 có ĐTH thấp (7,0) thì có sản phẩm PCR tương đương với 350bp.. - Hình 2: Điện di sản phẩm PCR với chỉ thị SSIIa. - Nghiên cứu nhiệt độ trở hồ của các giống lúa bằng phương pháp đánh giá kiểu hình và sự liên kết của kiểu hình này với các chỉ thị phân tử SSIIa, Jin et al. - (2010) đã cho thấy kiểu gen SSIIa-TT đồng hợp có ĐTH thấp tương ứng với sản phẩm PCR có kích thước 350 bp. - Trong khi đó, kiểu gen SSIIa-GC đồng hợp thể hiện ĐTH cao hoặc trung bình tương ứng với sản phẩm PCR có kích thước 550 bp. - Trong nghiên cứu cũng có những kết quả tương tự như vậy, ngoài ra những giống bị lẫn tạp hay những dòng còn đang phân ly có sản phẩm PCR xuất hiện cùng lúc hai band 350 và 550bp (trong nghiên cứu này hai giống MTL480, MTL540 có thể đã bị lẫn tạp và dòng Jasmine85-45 còn đang phân ly).. - (2006) đã cho thấy có sự tương quan 90-94% giữa ĐTH và chỉ thị SSIIa. - Do đó, chỉ thị SSIIa có thể được sử dụng trong các phân tích chẩn đoán để dự đoán sớm ĐTH của các giống lúa.. - 3.3 Đánh giá tính kháng rầy bằng phương pháp thanh lọc trong nhà lưới và bằng chỉ thị phân tử. - Gen Bph25 nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 và đồng phân ly với chỉ thị S00310, gen này cũng nằm rất gần so với 2 gen kháng rầy khác là Bph3 và bph4 (Myint et al. - Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng chỉ thị trên để kiểm tra tính liên kết với gen Bph25 trên một số giống lúa.. - Hình 3: Điện di sản phẩm PCR của chỉ thị S00310. - M: thang chuẩn 100 bp Bảng 4: Đánh giá tính kháng rầy trong nhà lưới. - và bằng chỉ thị S00310 STT Giống/dòng lúa Cấp. - kháng rầy. - Tính kháng rầy với chỉ thị S00310 1 HĐ1 (ĐC kháng) 2,0 Kháng. - Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 3%. - Để đánh giá hiệu quả của chỉ thị S00310, kết quả phân tích sản phẩm PCR được so sánh với kết quả đánh giá tính kháng rầy trong nhà lưới (Bảng 4) đã cho thấy những giống lúa có cấp kháng rầy từ 2,0-3,0 (có kiểu hình kháng rầy) thì tương ứng với sản phẩm PCR là 210bp (có kiểu gen kháng), những giống lúa có cấp kháng rầy từ 5,0-9,0 (có kiểu hình nhiễm vừa đến nhiễm nặng) thì tương ứng với sản phẩm PCR là 230bp (có kiểu gen nhiễm), ngoại trừ giống MTL856 có cấp kháng rầy 6,0 nhưng lại có sản phẩm PCR 210bp (tương ứng kiểu gen kháng). - Tóm lại, trong 13 giống/dòng được sử dụng trong nghiên cứu này đã cho thấy đánh giá bằng chỉ thị S00310 cho kết quả M. - giống/dòng tương đồng với đánh giá kiểu hình kháng rầy trong nhà lưới, hiệu quả đạt 92%.. - Nghiên cứu này đã cho thấy rằng mối tương quan giữa việc sử dụng các chỉ thị phân tử với các phương pháp đánh giá truyền thống về mùi thơm, ĐTH và tính kháng rầy ở lúa là rất cao. - Vì vậy, các chỉ thị phân tử chức năng này có thể được sử dụng trong các phân tích chẩn đoán để dự đoán tính trạng mùi thơm là đồng hợp hay dị hợp, ĐTH cao hay thấp hoặc lúa có khả năng kháng rầy hay không. - Các chỉ thị phân tử này có thể được sử dụng rộng rãi trong các chương trình chọn tạo giống lúa nếu như bố mẹ có kiểu alen khác nhau hoặc trong một quần thể còn đang phân ly.. - Các thí nghiệm được tiến hành có sử dụng trang thiết bị của phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.