Hiệu quả giảm bệnh và cơ chế kích kháng liên quan đến enzyme phenylalanine ammonia-lyase và polyphenol oxidase đối với bệnh cháy bìa lá lúa khi phun qua lá với dịch trích lá sống đời

- VỚI DỊCH TRÍCH LÁ SỐNG ĐỜI.
- Dịch trích lá sống đời được khảo sát ở các nồng độ và 10% (w/v) bằng phương pháp phun qua lá tại thời điểm 7 và 14 ngày trước chủng bệnh.
- Trong điều kiện nhà lưới, nghiệm thức phun dịch trích 1% tại 14 ngày trước chủng bệnh thể hiện hiệu quả giảm bệnh đến 21 ngày sau chủng bệnh.
- Cơ chế kích kháng có liên quan đến khả năng giảm bệnh cháy bìa lá lúa của dịch trích lá sống đời.
- Điều này được chứng minh thông qua khảo sát hoạt tính enzyme phenylalanine ammonia-lyase và polyphenol oxidase.
- Khi cây lúa được phun dịch trích và được chủng bệnh với vi khuẩn Xoo, hoạt tính hai enzyme tăng, trong đó phenylalanine ammonia-lyase tăng tại thời điểm 2 ngày sau chủng bệnh, còn polyphenol oxidase tăng tại 4 ngày sau chủng bệnh..
- Hiệu quả giảm bệnh và cơ chế kích kháng liên quan đến enzyme phenylalanine ammonia-lyase và polyphenol oxidase đối với bệnh cháy bìa lá lúa khi phun qua lá với dịch trích lá sống đời.
- ở khu vực ở Đông Nam Á (Reddy et al., 1979.
- Mặt khác, nhiệt độ cao do tác động của biến đổi khí hậu đã góp phần làm cây lúa dễ mẫn cảm với vi khuẩn Xoo và tạo môi trường thuận lợi để mầm bệnh này phát triển (Webb et al., 2010)..
- Chand et al., 1979.
- Khan et al., 2012).
- Nhưng thuốc hóa học có giá thành khá cao (Fawcett and Spencer, 1970), dễ tích tụ gây ô nhiễm môi trường, đồng thời ảnh hưởng đến sức khỏe nông dân và người tiêu dùng (Schantz et al., 2001).
- Lai tạo giống lúa mang gen Xoo cũng là một biện pháp để quản lý bệnh cháy bìa lá (Bhasin et al., 2012), nhưng việc canh tác các giống kháng dễ phá vỡ tính kháng do quần thể vi khuẩn dễ đột biến, làm xuất hiện chủng vi khuẩn mới có độc tính cao hơn (Khoa, 2005;.
- Webb et al., 2010).
- Mặc khác, lai tạo thành công một giống kháng tốn nhiều thời gian và chi phí dẫn đến giá thành sản xuất cao (Khoa et al., 2011).
- aerophilus (Nguyễn Đặng Ngọc Giàu, 2014), xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (Phuong Hoa et al., 2014) đang được quan tâm.
- Tuy nhiên, việc phát tán số lượng lớn vi sinh vật dễ làm thay đổi quần thể vi sinh vật bản địa hoặc chúng có thể bị biến đổi di truyền trở thành vi sinh vật gây hại (Duffy et al., 2003.
- Gần đây, kích thích tính kháng bệnh trên cây lúa (gọi tắt là kích kháng) là phương pháp giúp cây lúa bị nhiễm bệnh có khả năng kháng được bệnh ở một mức độ nào đó sau khi được xử lý bằng tác nhân kích kháng (Kloepper et al., 1992), được xem là phương pháp quản lý bệnh hại trên cây trồng hiệu quả, bền vững và thân thiện với môi trường (Walters et al., 2014).
- nhằm ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh (Vidhyasekaran et al., 1997.
- van Loon et al., 1998).
- Các tác nhân kích kháng có thể là vi sinh vật, chất hóa học, dịch trích thực vật.
- Quản lý bệnh bằng việc sử dụng tác nhân kích kháng có nguồn gốc tự nhiên như dịch trích thực vật sẽ lợi thế như phương pháp thực hiện đơn giản, tận dụng nguồn tài nguyên tại chỗ và ít tích tụ các hóa chất gây độc cho con người và động vật.
- Ở Việt Nam, khảo sát dịch trích cỏ hôi (Eupatorium odoratum) (Trần Thị Thu Thủy và Hans Jorgen Lyng Jorgensen, 2016), húng quế (Ocimum basilicum), sống đời (Kalanchoe pinnata) (Khoa et al., 2017) bằng phương pháp ngâm hạt, bước đầu đã có hiệu quả trên bệnh cháy bìa lá, đốm nâu và đốm vằn.
- Tuy nhiên, dưới áp lực bệnh ngày càng cao, xử lý dịch trích thực vật xa thời điểm cây lúa nhạy cảm nhất với bệnh làm cơ chế kích kháng của cây ít phát huy tác dụng hoặc không kích thích tính kháng kịp thời với mầm bệnh.
- Do đó, đề tài được thực hiện nhằm khảo sát hiệu quả giảm bệnh và cơ chế kích kháng liên quan đến enzyme phenylalanine ammonia-lyase (PAL) và polyphenol oxidase (PPO) của dịch trích lá sống đời bằng biện pháp phun qua lá đối với bệnh cháy bìa lá lúa, là cơ sở để ứng dụng vào thực tế phòng trị bệnh một cách hiệu quả, kinh tế, thân thiện với môi trường và thuận tiện cho người nông dân..
- 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Khảo sát hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá lúa của dịch trích lá sống đời bằng phương pháp phun qua lá trong điều kiện nhà lưới.
- Mỗi cây lúa trong một chậu tương đương một lần lặp lại, được chăm sóc và bón phân theo Khoa et al.
- 0,05 g FeSO 4 .7H 2 O và 15 g agar, nước cất vừa đủ 1000 mL, pH 7,0) và ủ ở nhiệt độ 28±2 o C (Karganilla et al., 1973).
- Chủng bệnh vào thời điểm 45 ngày sau khi gieo (NSKG), bằng phương pháp cắt chóp lá (Kauffman et al., 1973) có tẩm huyền phù vi khuẩn Xoo mật số 2x10 9 CFU/mL..
- Trước khi chủng bệnh, khử trùng kéo bằng cồn 70 o và cắt tại vị trí cách chóp lá 2-3 cm của tất cả lá trưởng thành (Khoa et al., 2017).
- Xử lý số liệu và chọn ra nghiệm thức có nồng độ dịch trích lá sống đời thấp nhất nhưng cho hiệu quả giảm bệnh tương đương nghiệm thức đối chứng dương..
- 2.2 Khảo sát hoạt tính enzyme trong mô lá lúa Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại, gồm 4 nghiệm thức: (1) phun dịch trích lá sống đời, có chủng bệnh.
- Nồng độ dịch trích sống đời được chọn từ thí nghiệm trên là 1% phun tại 14 NTCB (nồng độ thấp nhất nhưng cho hiệu quả giảm bệnh kéo dài đến 21 NSCB)..
- Các cặp nghiệm thức được thực hiện nhằm so sánh hoạt tính của enzyme khi chỉ có mầm bệnh (nước, chủng bệnh và nước, không chủng bệnh) và chỉ có mặt của dịch trích (dịch trích, không chủng bệnh và nước, không chủng bệnh).
- Tính kích kháng của dịch trích còn được so sánh thông qua cặp nghiệm thức (nước, không chủng bệnh) và (dịch trích, không chủng bệnh).
- Hoạt tính của enzyne.
- Thu dịch lỏng bên trên và tiến hành thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme..
- 2.2.2 Khảo sát hoạt tính enzyme phenylalanine ammonia-lyase (PAL).
- Hoạt tính enzyme PAL được thể hiện thông qua sự thay đổi giá trị hấp thụ quang phổ (hay còn gọi là mật độ quang) ở bước sóng 290 nm (ký hiệu OD 290nm ) của nồng độ sản phẩm trans-cinnamic acid trong phản ứng tách nhóm NH 2 từ L - phenylalanine dưới sự xúc tác của enzyme PAL..
- 2.2.3 Khảo sát hoạt tính enzyme PPO.
- Hoạt tính enzyme PPO được thể hiện thông qua sự thay đổi giá trị hấp thụ quang phổ (OD 490nm ) của nồng độ sản phẩm benzoquinone sinh ra từ phản ứng chuyển hóa catechol dưới sự xúc tác của enzyme PPO.
- Giá trị này có chiều hướng gia tăng theo thời gian phản ứng (Mayer et al., 1966.
- Nisha et al., 2012).
- 3.1 Hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới của dịch trích lá sống đời.
- Qua 3 thời điểm khảo sát, tại 7 NSCB, tất cả nghiệm thức được xử lý dịch trích lá sống đời ở hai thời điểm 7 và 14 NTCB đều có chiều dài vết bệnh tương đương nghiệm thức phun thuốc Starner 20 WP và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng âm (phun nước cất thanh trùng).
- Sau 14 ngày chủng bệnh, hiệu quả giảm bệnh thể hiện rõ khi được xử lý dịch trích 14 NTCB.
- Trong đó, phun dịch trích nồng độ 1%, 4% và 5% có chiều dài vết bệnh ngắn nhất và tương đương nghiệm thức phun thuốc hóa học.
- Đến 21 NSCB, chiều dài vết bệnh các nghiệm thức được xử lý dịch trích tại thời điểm 14 NTCB ngắn hơn 7 NTCB và tương đương nghiệm thức xử lý thuốc hóa học.
- Chỉ riêng phun dịch trích 2%.
- Hình 1: Chiều dài vết bệnh cháy bìa lá (mm) trên giống lúa Jasmine 85 An Giang tại 3 thời điểm 7, 14 và 21 ngày sau chủng bệnh (NSCB) khi phun dịch trích lá sống đời (Kalanchoe pinnata) ở các nồng độ và 10% (w/v) và được xử lý dịch trích ở 2 thời điểm A: vào 7 NTCB và B: vào 14 NTCB.
- So với phương pháp ngâm hạt cần nồng độ 1,5% (Khoa et al., 2017), phương pháp phun qua lá đòi hỏi nồng độ thấp hơn (1.
- Có thể do phun dịch trích sống đời gần thời điểm chủng bệnh hơn nên chỉ cần.
- lượng nhỏ dịch trích để tạo tín hiệu phân tử kích hoạt cơ chế kháng bệnh của cây.
- 3.2 Cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của dịch trích lá sống đời.
- Nguyên nhân làm hoạt tính enzyme PAL tăng liên quan mật thiết đến cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Xoo, chúng bắt đầu nhân mật số và di chuyển đến các mô lân cận sau khoảng 2-4 ngày nhiễm bệnh (Leach et al., 1989.
- Các enzyme trực tiếp tham gia vào cơ chế ngăn chặn vi sinh vật ký sinh sống trong cây được thực hiện như peroxide hoặc catalase (Khoa et al., 2017) sẽ được kích hoạt, cũng là nguyên nhân giảm hoạt tính PAL tại 4 NSCB.
- Khi chỉ phun dịch trích, hoạt tính enzyme PAL tăng nhanh đến ngày thứ hai, nhưng giảm xuống mức thấp tương đương nước, không chủng bệnh từ ngày khảo sát thứ 3 (Hình 2A).
- Khi có mặt đồng thời dịch trích sống đời và mầm bệnh, giá trị OD tăng vọt từ 1 NSCB và luôn giữ mức cao hơn các nghiệm thức còn lại đến 4 NSCB, đặc biệt đạt mức cao nhất tại 2 NSCB.
- Theo Xiangyang et al., (2009), enzyme PAL tham gia vào con đường sinh tổng hợp jasmonic acid (JA), các hợp chất hoạt hóa các gen kháng trong thực vật trong cơ chế tự vệ của cây..
- Tóm lại, khi phun dịch trích sống đời và có sự xâm nhiễm của vi khuẩn Xoo, hoạt tính enzyme PAL đặc biệt tăng cao hơn các nghiệm thức khác trong suốt 4 NSCB, và cao nhất được ghi nhận tại 2 NSCB..
- Hình 2: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme PAL (A) và PPO (B) trong mô lá của giống lúa Jasmine 85 An Giang ở những thời điểm cách nhau 24 giờ trong 7 NSCB.
- Cây lúa được xử lý với dịch trích lá sống đời nồng độ 1% (w/v) tại 14 NTCB.
- Hoạt tính enzyme PPO: Nghiệm thức nước- không chủng bệnh, sự thay đổi hoạt tính enzyme PPO là không đáng kể nếu xét từ lúc vừa chủng bệnh (từ 0 NSCB) đến ngày khảo sát thứ bảy (Hình 2B).
- JA, hai tính hiệu SA và JA có quan hệ điều hòa lẫn nhau (Constabel et al., 1995).
- Nếu chỉ phun dịch trích lá sống đời (nghiệm thức dịch trích-không chủng bệnh), hoạt tính PPO tăng đến ngày khảo sát thứ 5.
- Nhưng khi có mặt cả dịch trích và mầm bệnh, trị số OD 490nm tăng vọt trong suốt 4 NSCB, cao nhất tại 4 NSCB nhưng giảm nhanh (Hình 2B).
- Hoạt tính enzyme phenylalanine ammonia-lyase (OD 290nm/phút/g mô lá) Hoạt tính enzyme polyphenol oxidase (OD290nm/phút/g mô lá).
- Nhìn chung, cây luôn có những cơ chế tự vệ giúp giảm sự tấn công của các tác nhân bên ngoài và giảm biểu hiện bệnh đến mức thấp nhất (Garcion et al., 2014).
- Tuy nhiên, phun dịch trích sống đời 1% tại 14 NTCB chỉ mới là điều kiện cần để kích thích cây lúa hoạt hóa enzyme cần thiết cho cơ chế tự vệ, điều kiện đủ là phải có sự tấn công của mầm bệnh thì hoạt tính các enzyme sẽ được kích hoạt một cách mạnh mẽ, giúp bảo vệ cây lúa trước sự xâm nhiễm và phát triển của mầm bệnh tốt hơn.
- Dễ dàng nhận thấy từ kết quả thí nghiệm trên khi so sánh với nghiệm thức không xử lý dịch trích sống đời hay chỉ xử lý dịch trích lá sống đời nhưng vắng mặt mầm bệnh (Hình 2A và 2B)..
- Kết quả phù hợp với các nghiên cứu của Kagale et al.
- (2004), Govindappa et al.
- (2011), Nisha et al..
- (2012), Shivalingaiahand Sateesh (2013) và Khoa et al.
- (2017) trong quản lý bệnh cháy bìa lá lúa bằng dịch trích cây Cang mai (A.
- Tác giả đều ghi nhận hoạt tính enzyme PAL và PPO tăng cao nhất lần lượt tại 3 và 4 NSCB, chứng tỏ rằng 2 enzyme này có vai trò quan trọng trong kháng bệnh cháy bìa lá lúa..
- Sự khác nhau về thời gian tăng hoạt tính 2 enzyme (PAL tăng cao nhất vào 2 NSCB và PPO tại 4 NSCB, Hình 2A và 2B) khi có mặt đồng thời dịch trích lá sống đời và mầm bệnh Xoo, bởi chúng giữ vai trò khác nhau trong cơ chế kháng bệnh của cây lúa.
- PAL giữ vai trò quan trọng trong chu trình phenylpropanoid và xúc tác cho phản ứng chuyển L -phenylalanine thành trans-cinnamic acid trong phản ứng đầu tiên của chuỗi sinh tổng hợp các hợp chất phenol như flavonoid và isoflavonoid, phytoalexin và các đơn phân của lignin (Tanaka et al., 1989.
- Garcion et al., 2014).
- Các hợp chất này có chức năng chính giúp cây chống mầm bệnh (Mierziak et al., 2014).
- Xét về mầm bệnh, Xoo thường bắt đầu nhân mật số và lây lan đến các vùng lân cận khoảng sau 2-4 ngày chủng bệnh (Leach et al., 1989).
- Sự tăng hoạt tính của 2 enzyme PAL và PPO trong 2 đến 4 NSCB đặc biệt có ý nghĩa trong cơ chế kháng bệnh của cây.
- Thaler et al., 2012).
- Còn có tín hiệu khác là SA là nguyên nhân tích lũy ROS và H 2 O 2 , giúp cây trồng chống lại sự tấn công của các mầm bệnh ký sinh trong mô sống (Rao et al., 1997.
- Shetty et al., 2007.
- Shetty et al., 2008).
- Hai đường truyền tín hiệu này lại có quan hệ ức chế lẫn nhau (Thaler et al., 2012).
- Trong nghiên cứu này, giá trị hấp thụ quang phổ khi khảo sát hoạt tính enzyme PAL (3,0-7,5) và PPO cao hơn khi so sánh với nghiên cứu của Khoa et al.
- Sự khác nhau này có thể do các hợp chất trong dịch trích lá sống đời (các phân tử kích hoạt tín hiệu) có khả năng kích hoạt đường truyền tín hiệu JA mạnh mẽ hơn, cũng được lý giải cho hoạt tính PAL tăng sớm ở 2 NSCB thay vì 3 NSCB (Govindappa et al., 2011;.
- Khoa et al., 2017).
- giải cơ chất này (Khoa et al., 2017), có thể lý giải chính sự ức chế lẫn nhau giữa 2 đường truyền tín hiệu JA và SA mà ở nghiệm thức nước-chủng bệnh hoạt tính enzyme PAL và PPO chỉ tăng đến 3 NSCB và giảm ở những ngày tiếp theo (Hình 2A và 2B)..
- Walters et al., 2014).
- Đề tài đã khảo sát được khả năng làm giảm bệnh cháy bìa lá lúa của dịch trích lá sống đời thông qua phương pháp phun qua lá trước chủng bệnh, trong đó tuyển chọn được nồng độ dịch trích 1% được phun 14 NTCB là nồng độ thấp nhất nhưng vẫn thể hiện hiệu quả giảm bệnh ổn định đến 21 NSCB.
- Cơ chế kích kháng được chứng minh giữ vai trò quan trọng đến khả năng giảm bệnh, thể hiện qua sự tăng hoạt tính của enzyme PAL (cao nhất 2 NSCB) và PPO (cao nhất 4 NSCB) trong mô lá đối với nghiệm thức phun dịch trích lá sống đời và chủng bệnh 45 NSKG..
- In: Walters, D.R., Newton, A.C., and Lyon, G.D.
- Khoa, N.Đ, Xạ, T.V., and Hào, L.T., 2017.
- Mizukami, T., and Wakimoto, S., 1969.
- Reddy, A.P.K., Mackenzie, D.R., Rouse, D.I and Rao, A.V., 1979.
- In: Jacobs, T., and Parlevliet, J.E.
- Quản lý bệnh hại lúa bằng dịch trích thực vật