Khả năng phân giải protein, lipid, tinh bột, chitin và ức chế nấm của vi khuẩn vùng rễ được phân lập từ cây tiêu (Piper nigrum L.) trồng ở huyện Chơn Thành, tỉnh Bình Phước

- KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PROTEIN, LIPID, TINH BỘT, CHITIN VÀ ỨC CHẾ NẤM CỦA VI KHUẨN VÙNG RỄ ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) TRỒNG Ở HUYỆN CHƠN THÀNH, TỈNH BÌNH PHƯỚC.
- Nghiên cứu được thực hiện trên 22 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ vùng rễ cây tiêu và đã xác định khả năng cố định đạm, hòa tan phosphate, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore trong một nghiên cứu trước đây.
- Khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ bao gồm tinh bột, protein, lipid, chitin và sự ức chế nấm của các vi khuẩn này đã được nghiên cứu bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
- Kết quả cho thấy số lượng các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột, protein, chitin và lipid lần lượt là và 10 chủng.
- Khả năng phân giải protein, lipid, tinh bột, chitin và ức chế nấm của vi khuẩn vùng rễ được phân lập từ cây tiêu (Piper nigrum L.) trồng ở huyện Chơn Thành, tỉnh Bình Phước.
- Trên thế giới, hiện có nhiều công trình nghiên cứu trên đối tượng các PGPR sở hữu cùng lúc khả năng đối kháng sinh học và phân giải sinh học.
- Các PGPR có khả năng sinh enzyme ngoại bào như protease, cellulase, chitinase, lipase đã được phân lập và xác định đặc tính.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy bốn chủng Bacillus amyloliquefaciens (WW6), Bacillus atrophaeus (MPB), Bacillus subtilis (CBF) and Bacillus vallismortis (WW14) có khả năng sản xuất các enzyme như cellulase, protease, và ức chế các nấm như Colletotrichum.
- Trong đó, Fusarium solani thường được phân lập từ các cây bị vàng lá và có khả năng gây hại khi kết hợp với tuyến trùng Meloidogyne incognita (Thuy et al., 2013)..
- 2.2.2 Khảo sát khả năng phân giải tinh bột, lipid, protein, và chitin.
- Công thức các loại môi trường chỉ thị Môi trường “Mt1” (3 g cao thịt, 5 g peptone, 2 g tinh bột tan, pH 7,0) được sử dụng để kiểm tra khả năng phân giải tinh bột (Geetha et al., 2003).
- Môi trường “TBA – olive oil” (5 g peptone, 3 g cao nấm men, 10 mL dầu olive, 0,05 g rhomadine B, pH 7,2) được sử dụng để kiểm tra khả năng phân giải lipid (Eugenia et al., 2016).
- Môi trường “Skim milk” (5 g peptone, 3 g cao thịt, 1 g cao nấm men, 300 mL sữa gầy, pH 6,5) được sử dụng để kiểm tra khả năng phân giải protein (Sokol et al., 1979).
- 7H 2 O, 0,001 g ZnSO 4 , 0,001 g MnCl 2 , 0,5 g keo chitin, pH 6,5) được sử dụng để kiểm tra khả năng phân giải chitin (Hsu and Lockwood et al., 1975)..
- Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ.
- Phương pháp khuếch tán giếng thạch đã được sử dụng để đánh giá khả năng phân giải các chất (Balouiri et al., 2016).
- Để làm rõ sự xuất hiện của vòng halo, cần tiến hành nhuộm màu đĩa thạch với dung dịch Lugol’s chứa 150 mg/mL iodine (5 g iodine và 10 g potassium iodide trong 100 mL nước cất) đối với thí nghiệm xác định khả năng phân giải tinh bột, và với dung dịch Congo Red 0,1% (trong 15 phút.
- rửa lại bằng NaCl 1M) đối với thí nghiệm xác định khả năng phân giải chitin.
- Đối với thí nghiệm xác định khả năng phân giải lipid, sự phát huỳnh quang của phức hợp lipid và Rhomadine B dưới ánh đèn UV ở bước sóng 365 nm sẽ làm rõ sự xuất hiện của vòng halo.
- Riêng đối với sự phân giải protein, sự phân giải protein trong sữa sẽ tạo thành vòng halo trong hơn trên nền môi trường màu trắng đục.
- Đánh giá khả năng phân giải các chất hữu cơ Khả năng phân giải chất hữu cơ của các chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua kích thước vòng.
- Trong đó, KNPG là “khả năng phân giải cơ chất”, D là đường kính vòng halo và d là đường kính khuẩn lạc (đơn vị là cm)..
- 2.2.3 Khảo sát khả năng kháng nấm.
- Đối với khảo sát khả năng kháng nấm, sử dụng phương pháp cấy kép của Shrivastava et al.
- Sau 7 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát và ghi nhận các chủng có khả năng kháng nấm.
- Riêng thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm, sử dụng thêm một đối chứng âm khác đó là môi trường nuôi cấy vi khuẩn lỏng vô trùng để loại trừ tác dụng ức chế nấm có thể có trong thành phần môi trường này (LB lỏng).
- Đối với sự định danh vi khuẩn, các chủng có khả năng phân giải chất hữu cơ và kháng nấm tốt đã được tuyển chọn và cấy chuyển trên môi trường thạch đĩa LB.
- 3.1 Khả năng phân giải protein, lipid, tinh bột và chitin của 22 chủng vi khuẩn vùng rễ cây tiêu.
- Hoạt tính phân giải các cơ chất hữu cơ bao gồm tinh bột, lipid, protein, chitin mà nghiên cứu này đã tiến hành dò tìm thông qua sự xuất hiện vòng halo cũng đã được nhiều tác giả trên thế giới thực hiện.
- Các tác giả cũng đã liên hệ hoạt tính này với khả năng sản xuất các enzyme tương ứng gồm amylase, lipase, protease và chitinase và đặc biệt là với tính kháng nấm (ngoại trừ amylase).
- Trong nghiên cứu nảy, khả năng phân giải protein, lipid, tinh bột và chitin, của 22 chủng vi khuẩn vùng rễ cây tiêu đã được đánh giá thông qua sự tạo vòng halo.
- Kết quả cho thấy có 21 chủng có khả năng tinh bột, 10 chủng có khả năng phân giải lipid, 20 chủng có khả năng phân giải protein, và 12 chủng có khả năng phân giải chitin (Bảng 1)..
- Bảng 1: Khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của 22 chủng PGPR.
- STT Tên dòng Khả năng phân giải (cm).
- 3.1.1 Khả năng phân giải tinh bột.
- Qua đó cho thấy, ngoại trừ chủng ML6.3, hai mươi mốt chủng còn lại đều có khả năng phân giải tinh bột với khả năng phân giải đạt từ 0,2 đến 1,13 cm.
- Trong đó có 5 chủng có khả năng phân giải thấp hơn 0,5 cm.
- 16 chủng có khả năng phân giải đạt từ 0,5 đến 1,0 cm, và một chủng có khả năng phân giải đạt trên 1,0 cm..
- Năm chủng phân giải tinh bột tốt nhất là MH13, CT5, ML17.1, MH9 và TT6..
- kháng nấm, nhưng trong việc dò tìm khả năng phân giải chất của các PGPR, nhiều tác giả cũng đã sử dụng môi trường chứa tinh bột tan để phát hiện khả năng phân giải cơ chất này.
- (2016) đã tập trung nghiên cứu về đa dạng kiểu hình của các vi khuẩn vi khuẩn vùng rễ có khả năng tiết xuất amylase, đóng vai trò quan trọng trong sự phân giải chất xác bã thực vật có chứa tinh bột.
- Trong 137 chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng tiết amylase phân lập từ 8 loại cây thường mọc ở Algeria (Bắc Phi), các tác giả nhận thấy hoạt động amylase của các vi khuẩn phân lập từ 3 loại cây carob (Ceratonia siliqua), argan (Argania spinosa) và sung ngọt (Ficus carica) là đặc biệt mạnh.
- Khả năng phân giải của các dòng tốt nhất dao động từ 2,9 mm – 5,0 mm..
- Khả năng phân giải tinh bột hay hoạt động của amylase cũng là đặc tính thường thấy của các PGPR..
- Trong 6 chủng vi khuẩn được tuyển chọn từ 140 chủng PGPR phân lập từ cây đậu xanh (Vigna radita L.) trồng tại Ấn Độ, có 5 chủng vi khuẩn (4 chủng Gram dương và một chủng Gram âm) biểu thị khả năng phân giải tinh bột (Geetha et al., 2014).
- trồng trên đất nhiễm mặn ở Xinjiang, Trung Quốc đều có khả năng tiết amylase ngoại bào (Wang et al., 2018).
- Ngoài vi nấm, các vi khuẩn như Bacillus subtilis, Clostridium acetobutylicum cũng đã được báo cáo về khả năng phân giải tinh bột (Dhawale et al., 1982;.
- Hình 1: Vòng halo được tạo ra bởi một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột (A), lipid (B), protein (C), và chitin (D).
- các mũi tên dùng để chỉ giới hạn của vòng halo 3.1.2 Khả năng phân giải lipid.
- Trong 22 chủng vi khuẩn đã khảo sát, có 10 chủng phân giải được lipid.
- Trong đó có 5 chủng có khả năng phân giải là 0,2 cm.
- 3 chủng có khả năng phân giải là 0,4 cm.
- và 2 chủng có khả năng phân giải là 0,6 cm (CT5, MH13)..
- Chính vì vậy, một số nghiên cứu về khả năng phân giải chất liên quan đến hoạt tính kháng nấm thường không xét đến khả năng phân giải lipid cũng như khả năng phân giải tinh bột như đã đề cập bên trên.
- Tuy nhiên, ở góc độ đối kháng sinh học nói chung, nhiều tác giả cũng đã tiến hành dò tìm khả năng phân giải lipid hoặc hoạt tính của lipase.
- cây đậu xanh cho thấy chỉ có 2 chủng biểu thị khả năng phân giải lipid.
- (2018), tất cả 13 chủng PGPR được phân lập từ cây ớt đều có khả năng này.
- Đối với khả năng phân giải lipid thể hiện qua kích thước vòng halo, trong nghiên cứu của Azman et al., (2017) được thực hiện trên các vi khuẩn liên kết cây lúa trồng tại Malaysia, khả năng này dao động từ 0,3 – 1,6 cm.
- Trong khi đó trong nghiên cứu của Dương Minh Lam và Vũ Thị Lý (2012), 8 chủng vi khuẩn được tuyển chọn từ 250 chủng vi khuẩn phân lập từ đất rừng ngập mặn Việt Nam lại có khả năng phân giải lipid đạt từ 1,7 – 2,1 cm.
- 3.1.3 Khả năng phân giải protein.
- Căn cứ trên sự xuất hiện của vòng halo có độ trong cao hơn so với môi trường màu trắng đục (Hình 1C bên trên), ngoại trừ 2 chủng TT11 và ML13.1, cả 20 chủng vi khuẩn còn lại đều có khả năng phân giải protein.
- Khả năng phân giải protein của các chủng đạt từ 0,2 đến 1,47 cm (tương đương.
- Trong đó, có 10 chủng có khả năng phân giải protein dưới 0,5 cm.
- 4 chủng có khả năng phân giải từ 0,5 đến dưới 1,0 cm.
- và 6 chủng có khả năng phân giải đạt từ 1,0 cm trở lên (TT5, CT5, ML4.32, ML4.31, TT2, và ML6.1).
- Kết quả về khả năng phân giải protein nêu trên cũng tương đồng với kết quả của một số công bố của một số tác giả khác.
- ví dụ như khả năng phân giải protein (đo theo đường kính vòng halo) của các PGPR liên kết cây lúa trồng tại Malaysia là cm (Azman et al., 2017), và của các PGPR liên kết cây ớt trồng ở Việt Nam là cm (Nguyễn Thị Liên và ctv., 2016).
- Protease là enzyme phân giải protein.
- Protease cùng với các enzyme có vai trò phân giải polysaccharide như chitinase, cellulase, β-1,3-glucanase đã được xem là các enzyme chịu trách nhiệm chính trong khả năng đối kháng nấm của PGPR (Jadhav et al., 2017)..
- Nhiều công trình nghiên cứu về PGPR nói chung và PGPR đối kháng sinh học nói riêng cũng đã tiến hành dò tìm khả năng sinh enzyme protase của các vi khuẩn, qua đó cho thấy tỷ lệ vi khuẩn có khả năng này thay đổi theo đối tượng cây chủ: chiếm 23,7%.
- 3.1.4 Khả năng phân giải chitin.
- Qua đó cho thấy có 12 chủng phân giải được chitin.
- trong đó có 7 chủng có khả năng phân giải đạt 0,2 cm, và 5 chủng có khả năng phân giải đạt từ 0,4 đến 0,53 cm (CT5, MH9, ML13.1, TT2, ML6.1)..
- Tỷ lệ vi khuẩn phân giải chitin thay đổi theo loại cây chủ: chiếm 12,5% trong số các vi khuẩn vùng rễ cây cỏ linh lăng Medicago sativa (Bharucha et al., 2013).
- Các nghiên cứu trên chỉ khảo sát khả năng phân giải chitin ở các dòng tuyển.
- (2016), tỷ lệ vi khuẩn phân giải chitin chiếm 77,21% trong số các PGPR liên kết cây ớt, với đường kính vòng halo đạt từ 0,17 đến 3,10 cm.
- (2016), 5 chủng Streptomyces có khả năng kháng Colletotrichum spp.
- gây bệnh thán thư hại gấc đã biểu thị vòng halo phân giải chitin có đường kính đạt từ 1,4 cm đến 2,7 cm sau 7 ngày nuôi cấy..
- 3.2 Khả năng kháng nấm.
- Kết quả khảo sát khả năng ức chế nấm của 22 chủng vi khuẩn theo phương pháp cấy kép cho thấy có 2 chủng có khả năng ức chế Fusarium sp.
- Riêng chủng ML17.1 còn có khả năng ức chế được cả 4 chủng nấm chỉ thị còn lại là Penicillium sp., Aspergillus niger, A.
- Hai chủng MH13 và ML17.1 có khả năng phân giải tinh bột, lipid và protein tốt.
- Riêng chủng MH13 còn có khả năng phân giải chitin.
- và bệnh héo cây khi chúng sở hữu khả năng phân huỷ fusaric acid do nấm này tiết ra (Saharan and Nehra, 2011)..
- Hình 2: Khả năng ức chế nấm của MH13 và ML17.1 đối với Fusarium sp.
- Dựa trên kết quả khảo sát khả năng phân giải các chất và kháng nấm nêu trên, có 4 chủng đã được chọn lọc để định danh bao gồm ML17.1, MH13, CT5, và TT5 theo phương pháp MALDI-TOF..
- trong khi giá trị độ tin cậy nằm trong khoảng từ 1,700 đến 1,999 sẽ cho kết quả chính xác đến mức “chi” và tên loài là “có khả năng”.
- Đối với hai loài đã được định danh là Bacillus subtilis và Alcaligenes faecalis, đây là các PGPR đã được báo cáo về khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật theo cơ chế trực tiếp lẫn gián tiếp (Saharan and Nehra, 2011), Năm 2017, Mardanova et al.
- Qua nghiên cứu cho thấy, loài này có khả năng kháng nấm bệnh, sản xuất siderophore, tiết enzyme protease và cellulase, sản xuất HCN..
- (2011) cũng đã phân lập được B.subtilis có khả năng kiểm soát sự phát triển của Aspergillus niger, A.
- Đối với Alcaligenes faecalis, đây là một loài PGPR có khả năng sản xuất các enzyme lipase, cellulase, chitinase, sinh tổng hợp IAA (Ghodsalavi et al.,.
- Kết quả nghiên cứu còn cho thấy đây vi khuẩn này có khả năng sản xuất siderophore tốt, giúp gia tăng sự hấp thu sắt cho cây trồng..
- Trong 22 chủng PGPR liên kết cây tiêu đã xác định được 21 chủng có khả năng phân giải tinh bột từ 0,2 đến 1,13 cm.
- 10 chủng có khả năng phân giải lipid từ 0,2 đến 0,6 cm.
- 20 chủng có khả năng phân giải protein từ 0,2 đến 1,47 cm.
- và 12 chủng có khả năng phân giải chitin từ 0,2 đến 0,53 cm.
- Có 2 chủng biểu thị khả năng kháng nấm.
- Trong đó, chủng MH13 có khả năng ức chế Fusarium sp.
- Chủng ML17.1 có khả năng ức chế cả 5 chủng nấm chỉ thị gồm Fusarium sp., Penicillium sp., Aspergillus niger, A.
- Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, tinh bột và protein trong nước rỉ từ bãi rác ở thành phố Cần Thơ.
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn từ đất vùng rễ ớt có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp