- KHẢ NĂNG SỬ DỤNG BÃ MÍA TRONG SẢN XUẤT CHẤT BÉO TỪ NẤM MEN YARROWIA LIPOLYTICA Po1G. - Vì vậy, việc phát triển công nghệ khác để sản xuất chất béo dùng cho quá trình sản xuất biodiesel là rất quan trọng.. - Trong đó, sản xuất chất béo thông qua quá trình lên men sử dụng các vi sinh vật cho dầu có thể là một cách thay thế cho các loại dầu thực vật truyền thống (Ratledge, 2008). - Nấm men Y. - lipolytica Po1g có khả năng tích lũy hàm lượng chất béo cao, thường được tìm thấy trong môi trường giàu các chất nền kỵ nước (hydrophobic substrate, HS). - Chúng phát triển những cơ chế phức tạp cho việc sử dụng hiệu quả những chất nền khác nhau như là nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng. - Chất béo trung tính thu được từ Y. - Gần đây, đang có khuynh hướng tận dụng các nguồn phế phẩm nông nghiệp (rơm, rạ) như là nguồn carbon trong quá trình nuôi cấy vi sinh để sản xuất chất béo, mặc dù vậy những công trình nghiên cứu vẫn đang còn rất hạn chế.. - Trong đó, bã mía – phụ phẩm của quá trình sản xuất đường, là nguồn nguyên liệu chứa lignocellulose, có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. - Tuy nhiên trong thời gian qua, các ứng dụng của bã mía chưa được khai thác triệt để, chỉ dừng lại ở việc dùng làm nhiên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy và ván ép dùng trong xây dựng,… Trong khi bã mía là nguồn lignocellulose tiềm năng cho quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi sinh vật do có hàm lượng carbonhydrate cao, hàm lượng chất ức chế thấp và là phế phẩm tại các nhà máy đường. - Chính vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng bã mía trong quá trình nuôi cấy Y.. - lipolytica Po1g để sản xuất chất béo phục vụ cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học là rất cần thiết. - Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm tìm ra điều kiện thích hợp cho phản ứng thủy phân bã mía bằng acid loãng để thu được dung dịch thủy phân có hàm lượng đường cao. - Đồng thời, nghiên cứu sẽ tận dụng các thành phần dinh dưỡng từ dung dịch bã mía thủy phân để nuôi cấy nấm men Y. - lipolytica Po1g nhằm sản xuất chất béo (dầu). - Qua đó đề xuất nguyên liệu thô rẻ tiền cho quá trình sản chất béo có quy mô công nghiệp, nâng cao giá trị của cây mía, đồng thời giải quyết một phần ô nhiễm môi trường.. - Bã mía được cung cấp từ các nhà máy chế biến đường, sau đó được rửa sạch bằng nước, sấy khô ở 50°C trong khoảng thời gian 24 giờ.. - Sau khi sấy, bã mía được xay nhỏ đạt kích thước khoảng 0.71 mm và được bảo quản ở 4°C để sử dụng.. - Hóa chất dùng trong quá trình nuôi cấy nấm men được cung cấp bởi các công ty khác. - 2.2 Thủy phân bã mía. - Bã mía được thủy phân theo phương pháp của (Chandel et al., 2007) với một số điều chỉnh nhỏ về nhiệt độ, thời gian và tỉ lệ bã mía/dung dịch acid. - Bã mía đã xử lý sơ bộ được trộn với H 2 SO 4 để thực hiện phản ứng thủy phân với điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định. - Sơ đồ 1 mô tả việc chuẩn bị DDBMTP cũng như quá trình nuôi cấy Y.. - lipolytica Po1g.. - 2.3 Quá trình khử độc sản phẩm thủy phân bã mía. - 2.4 Nuôi cấy nấm men. - môi trường bã mía thủy phân với tỷ lệ thể tích 1:10, sử dụng bình tam giác 500 mL với thể tích môi trường nuôi cấy là 250 mL, trong tủ nuôi cấy với nhiệt độ là 26°C và tốc độ lắc 160 vòng/phút. - sản phẩm thủy phân bã mía (đã khử độc và chưa khử độc), peptone (5 g/L), yeast extract (5 g/L).. - Nồng độ đường tổng trong sản phẩm thủy phân được xác định theo phương pháp DNS (Marsden et al., 1982. - Miller, 1959) dựa trên phản ứng tạo màu giữa DNS và đường khử 3 mL thuốc thử DNS được thêm vào 1 mL mẫu thủy phân đã pha loãng trong ống nghiệm được bọc giấy nhôm để tránh DNS phân hủy bởi ánh sáng. - 2.5.3 Xá địn àm l ợng chất béo. - Hàm lượng chất béo được phân tích bằng cách cân khối lượng.. - Hình 1: Sơ đồ quá trình thủy phân bã mía và nuôi cấy Y. - Trong quá trình thủy phân lignocellulose nói chung hay bã mía nói riêng các thông số như nhiệt độ, thời gian và nồng độ acid đóng vai trò quan trọng để thu được lượng đường tối ưu và sinh ra chất ức chế tối thiểu. - 3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ acid lên nồng độ đƣờng tổng. - Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid. - đến quá trình thủy phân, bã mía được thủy phân tương ứng với những nồng độ H 2 SO 4. - Kết quả thủy phân được thể hiện trong Hình 2.. - Có thể thấy rằng nồng độ acid ảnh hưởng rất quan trọng đến quá trình thủy phân, trong đó nồng độ đường tổng (NĐĐT) tăng tương ứng với tăng nồng độ acid. - Khi tăng nồng độ H 2 SO 4 từ 1% đến 3% làm tăng NĐĐT từ 10.32 đến 17.86 g/L. - Điều này chứng tỏ acid nồng độ cao có thể phá vỡ cấu trúc polymer của lignocellulose hiệu quả hơn. - Đây là sản phẩm phụ không mong muốn và là thành phần ức chế trong quá trình nuôi cấy nấm men. - H 2 SO 4 ở nồng độ 3%. - là hiệu quả nhất cho sự thủy phân bã mía, tương ứng với NĐĐT là 17.86 g/L.. - Bã mía - Sấy - Cắt nhỏ - Xay - Sàng Thủy phân bằng H 2 SO 4. - Bã rắn Dung dịch bã mía thủy phân. - Dung dịch bã mía thủy. - phân khử độc Dung dịch bã mía thủy phân không khử độc. - Nuôi cấy Xác định sự sinh trưởng sinh khối và chất béo. - Hình 2: Ảnh hƣởng của nồng độ acid đến nồng độ đƣờng tổng. - 3.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng. - Quá trình thủy phân được khảo sát ở các khoảng thời gian khác nhau từ 1 - 8 giờ, nhiệt độ 90°C, nồng độ acid đã tối ưu là 3%, tỉ lệ BM/DDA là 1/20. - Kết quả chỉ ra rằng NĐĐT tăng theo thời gian thủy phân, với thời gian thủy phân tối ưu là 6 giờ. - Khi tăng thời gian thủy phân từ 2 đến 4 giờ, NĐĐT tăng tương ứng từ 19.91 đến 21.13 g/L và đạt cực đại (23.69 g/L) tương ứng với 6 giờ thủy phân.. - Tuy nhiên, NĐĐT bắt đầu giảm còn 21.69 g/L khi thời gian thủy phân tăng lên 8 giờ (Hình 3). - Các công trình nghiên cứu tương tự cũng cho thấy NĐĐT tăng khi tăng thời gian thủy phân và nồng độ acid sử dụng và cho đến khi đạt được giá trị cực đại thì NĐĐT bắt đầu giảm dần sau đó (Tsigie et al., 2012. - Nguyên nhân chủ yếu là do sự chuyển hóa của phần tử đường thành các hợp chất không mong muốn khác ở điều kiện nồng độ acid cao và thời gian phản ứng dài.. - Hình 3: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng. - 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ bã mía/dung dịch acid đến nồng độ đƣờng tổng. - Tỉ lệ BM/DDA được tiến hành khảo sát với các tỉ lệ khác nhau thay đổi từ 1/20 đến 1/40 g/mL, tương ứng với điều kiện nồng độ axit 3%, nhiệt độ 90°C và thời gian là 6 giờ. - Kết quả khảo sát cho thấy rằng nồng độ đường. - tổng gần như giảm tuyến tính khi tăng tỉ lệ giữa bã mía và dung dịch acid sử dụng trong quá trình thủy phân (Hình 4). - Tuy nhiên, lượng đường thực tế thu được tính trên khối lượng bã mía sử 0. - Nồng độ đường tổng (g/L). - Nồng độ acid. - Nồng độ đường tổng(g/L). - Thời gian (giờ). - Như vậy, nếu bã mía được sử dụng là 1 g thì lượng đường thu được lần lượt là và. - Từ kết quả cho thấy việc chọn khảo sát tỉ lệ BM/DDA là quan trọng, trong tỉ lệ 1/25 g/mL được xem là kết quả tối ưu cho quá trình thủy phân.. - Hình 4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mía/dung dịch acid đến nồng độ đƣờng tổng. - 3.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến nồng độ đƣờng tổng. - Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân được khảo sát từ 60 - 120°C, trong đó nồng độ axit 3%, tỉ lệ BM/DDA 1/25 g/mL và thời gian 6 giờ là điều kiện cố định. - Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ đường tổng tăng nhanh khi tăng nhiệt độ thủy phân (Hình 5).. - Tuy nhiên, nếu tăng nhiệt độ lên cao trên 90°C thì hàm lượng đường giảm do xảy ra quá trình caramen hóa đường ở nhiệt độ cao và thời gian dài. - Hơn thế nữa, khi thực hiện phản ứng thủy phân ở 120°C trong 6 giờ, đường bị phân hủy hoàn toàn thành carbon. - Vì vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân trong nghiên cứu này là 90°C.. - Hình 5: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến nồng độ đƣờng tổng. - Ảnh hưởng của nguồn cung cấp carbon lên quá trình phát triển của Y. - lipolytica Po1g được khảo sát với 4 nguồn cung cấp carbon khác nhau như sau: (i) dung dịch bã mía thủy phân. - lipolytica Po1g. - Kết quả cho thấy nấm men phát triển tốt nhất trong dung dịch bã mía thủy phân đã qua khử độc và hàm lượng sinh khối đạt giá trị tối đa là 12.07 g/L. - Trong khi đó giá trị cực đại của sinh khối thu được trong các môi trường chứa D-glucose, D-xylose, dung dịch bã mía thủy phân không khử độc lần lượt là và 2.11 g/L. - Việc nuôi cấy trong dung dịch bã mía thủy phân chưa qua khử độc cho kết quả thấp nhất bởi vì có sự hiện diện của các chất ức chế như furfural, HMF và đặc biệt là pH môi trường quá thấp.. - Điều này có thể giải thích là do vi sinh vật sử dụng lại chất béo như là nguồn cung cấp carbon cho sự sinh trưởng (Huang et al., 2009).. - 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng tổng đến hàm lƣợng sinh khối và chất béo. - Hàm lượng sinh khối cũng như hàm lượng chất béo thu được chịu sự ảnh hưởng của nồng độ đường tổng trong dung dịch bã mía thủy phân. - lipolytica Po1g trong môi trường bã mía thủy phân đã được khử độc tương ứng với NĐĐT khác nhau từ 10 - 40 g/L, với thời gian lên men là 4 ngày. - Khi NĐĐT sử dụng là 10 g/L thì sinh khối thu được là thấp nhất 4.12 g/L, tương ứng với lượng chất béo sinh ra chỉ 1.1 g/L, (chiếm 26.7% sinh khối). - Sau đó lượng sinh khối tăng lên 12.07 g/L (lượng chất béo tích lũy là 3.87 g/L, chiếm 32.1%) khi NĐĐT trong bã mía thủy phân là 20 g/L.. - Lượng sinh khối thu được cao nhất là 13.25 g/L (chất béo là 6.19 g/L, chiếm 46.7. - tương ứng với dung dịch thủy phân có NĐĐT là 30 g/L. - Tuy nhiên khi NĐĐT tăng lên 40 g/L thì lượng sinh khối thu được bị giảm xuống 8.33 g/L và chất béo sinh ra 2.96 g/L 0. - Hàm lượng sinh khối (g/L). - sản xuất ethanol bởi vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae sử dụng môi trường lignocellulose thủy phân. - Khi dung dịch thủy phân có NĐĐT cao sẽ gây ra tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật (Zhao &. - Bảng 1: Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng tổng lên hàm lƣợng sinh khối và chất béo sinh ra Nồng độ đƣờng tổng,. - Kết quả nghiên cứu đã chứng minh khả năng sử dụng bã mía cho quá trình thủy phân đường là rất khả quan. - Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân như nồng độ acid, thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ bã mía / dung dịch acid đã được khảo sát và xác định được điều kiện tối ứu cho quá trình thủy phân bã mía (H 2 SO 4 3%, 90°C, 6 giờ, tỉ lệ 1/25 g/mL). - Đồng thời, quá trình nuôi cấy nấm men Y.lipolytica Po1g cho thấy sản phẩm thủy phân bã mía đã khử độc có thể được sử dụng như một nguồn carbon thay thế hiệu quả cho quá trình nuôi cấy nhằm sản xuất chất béo do hàm lượng sinh khối và chất béo thu được khá cao. - Chính vì thế bã mía thủy phân có thể xem như là nguyên liệu tiềm năng dùng để nuôi cấy nấm men cho dầu.