Khác biệt về hệ phiên mã dưới tác động của mặn lên 2 giống lúa mùa ở giai đoạn cây con

- KHÁC BIỆT VỀ HỆ PHIÊN MÃ DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MẶN LÊN 2 GIỐNG LÚA MÙA Ở GIAI ĐOẠN CÂY CON.
- 2 Viện Nghiên cứu Phát triển Đồng bằng sông Cửu Long, Trường Đại học Cần Thơ.
- Do đó, việc tìm ra hệ gien biểu hiện ở các giống lúa chống chịu mặn đại diện cho vùng Đồng bằng Sông Cửu Long là cấp thiết.
- Ở nghiên cứu này giống Đốc Phụng đại diện cho kiểu gien chống chịu stress mặn, nếp Mỡ đại diện cho kiểu gen mẫn cảm stress mặn, 2 giống lúa được chọn cho nảy mầm và 14 ngày sau nảy mầm, cây con được xử lý muối NaCl ở nồng độ 100 mM cho 12 giờ, mẫu sau khi xử lý stress mặn được thu thập và ly trích RNA.
- Kết quả phân tích hệ gien biểu hiện cho thấy giống Đốc Phụng (1596 gen) có số lượng gen biểu hiện nhiều hơn giống nếp Mỡ (427 gen), và hầu hết các gen ở hai giống thí nghiệm đều phản ứng tới stress mặn liên quan đến chức năng kích thích phản ứng bởi stress..
- Kết quả này bước đầu đã chọn ra được các gien liên quan đến phản ứng stress mặn như họ gien OsDREB, và có thể dùng tiếp cho nghiên cứu chuyên sâu hơn..
- Đứng trước thực trạng đó, các nhà khoa học Việt Nam đã và đang nghiên cứu chọn tạo các giống lúa có khả năng thích ứng trong điều kiện xâm nhiễm mặn, nhằm đảm bảo an ninh lương thực..
- Để vận hành được các cơ chế đó, cây lúa phải trãi qua quá trình phiên mã các hệ gien liên quan đến các cơ chế chống chịu mặn khi có sự tác động của mặn.
- Được biết ở giai đoạn cây con, cây lúa rất mẫn cảm với mặn vì vậy nghiên cứu về hệ gien biểu hiện ở giai đoạn cây con liên quan đến khả năng chịu mặn ở các giống lúa chịu mặn đã được rất nhiều nghiên cứu như trên lúa hoang Dongxiang (Oryza rufipogon Griff) (Zhou et al.
- 2016), giống lúa Chibo (Chandran et al.
- 2019), giống lúa Xian156 (Wang et al.
- 2018), và một trong những giống lúa được xem là chuẩn chống chịu mặn được rất nhiều nghiên cứu về mặn là Pokkali (Li et al.
- Trong khuôn khổ của nghiên cứu này, đã ứng dụng kỹ thuật nghiên cứu hệ gien biểu hiện ở giai đoạn cây con của giống lúa chịu mặn địa phương của ĐBSCL được thực hiện nhằm tìm ra các gien có phản ứng sớm liên quan đến khả năng chống chịu mặn.
- Kết quả nghiên cứu này là tiền đề giúp chọn tạo ra các giống lúa chống chịu mặn phục vụ cho ĐBSCL trong tương lai..
- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- Vật liệu nghiên cứu.
- Theo nghiên cứu của (Tam 2019), giống Đốc Phụng chống chịu mặn tốt, và giống nếp Mỡ là đại.
- diện cho giống mẫn cảm với mặn và hai giống này là giống lúa mùa của ĐBSCL và cùng hệ gen indica..
- Do đó, trong nghiên cứu này giống Đốc Phụng (ĐP) là giống chống chịu mặn và giống nếp Mỡ (NM) là giống mẫn cảm với mặn, cả hai giống được thu thập tại ĐBSCL và hiện đang lưu giữ tại ngân hàng gen, Trường Đại học Cần Thơ..
- Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.
- Xử lý stress mặn.
- Hạt giống lúa Đốc Phụng và nếp Mỡ sau khi được lấy từ kho lạnh được để ở nhiệt độ phòng cho 24 giờ sau đó được ngâm trong nước cất trong bóng tối, và các hạt nảy mầm đồng đều được gieo trong hộp nhựa.
- Để dùng cho nghiên cứu hệ gen biểu hiện giai đoạn sớm của cây con (RNA-seq), cây con 14 ngày tuổi được xử lý mặn ở nồng độ 100 mM NaCl (nồng độ mặn tương đương 6‰) và 0 mM NaCl (đối chứng) trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida cho 12 giờ, sau đó toàn bộ phận của cây con (thân, lá và rễ được rửa sạch) được thu hoạch và làm đông ngay lập tức trong nitơ loãng, mẫu vật được tồn trữ ở - 80℃.
- RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu xử lý bằng cách sử dụng bộ RNeasy ® Plant Mini theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Qiagen, Đức).
- Phân tích hệ gien biểu hiện (transcriptome) Đọc quá trình lọc và đánh giá biểu hiện gien khác biệt.
- Sau khi dữ liệu giải trình tự được xuất từ máy, dữ liệu được tiến hành kiểm soát chất lượng và xử lý trước các lần đọc đầu cuối, ghép nối thô được thực hiện bằng công cụ fastp V0.20.0, một bộ tiền xử lý FASTQ cực nhanh (Chen et al.
- Các lần đọc hệ phiên mã được so sánh lên hệ gien tham chiếu Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0 mới nhất (Kawahara et al.
- Kim et al.
- 2015), và những hệ gien biểu hiện được dò tìm trên hệ gien tham chiếu có chất lượng thấp (MAPQ<30) được loại bỏ bằng phần mềm SAMtool kits (Li et al.
- Tiếp tục phân tích hệ gien phiên mã, DESeq2 (Love et al.
- 2014) được sử dụng để tìm mức độ biểu hiện khác nhau ở các gien biểu hiện (Differentially Expressed Genes ~ DEG) khi so sánh giữa mẫu đối chứng (không xử lý mặn) và mẫu xử lý mặn.
- Trước đó, số lần gien biểu hiện được tính bằng featureCounts (Liao et al.
- 2014), được tính là mức biểu hiện ban đầu với 1 gien được định vị trên bộ gien (gtf) có sẳn trên web (https://rapdb.dna..
- Các mức độ biểu hiện gien đã được tiêu chuẩn hóa bằng các cơ sở số lần đọc trên Kilo trên triệu lần đọc (RPKM).
- Ở bước này, những thay đổi lớn hơn 2 lần của mức độ biểu hiện có sự khác biệt có ý nghĩa (P <0,05) làm điều kiện để sàng lọc ý nghĩa của DEG giữa stress muối và mẫu đối chứng..
- Bước tiếp theo là các gien biểu hiện được phân nhóm theo chức năng của chúng (Gene Ontology [GO] enrichment analysis), phương pháp Singular Enrichment Analysis (SEA) được thực hiện nhờ phần mềm AgriGO V.2, với các mặc định cài đặc hệ số (False-Discovery Rate ~ FDR) với hệ số giá trị p.
- dựa vào các ID của gien tham chiếu trên lúa được ghi nhận trên NCBI (Tian et al.
- Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2019 tại phòng thí nghiệm Di truyền và Chọn giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ..
- Dữ liệu hệ gien được giải trình tự Nhằm tìm hiểu cơ chế chống chịu stress mặn của các giống lúa chịu mặn mùa đại diện cho ĐBSCL ở cấp độ phân tử, kỹ thuật RNA-seq giải trình tự hệ gien biểu hiện ở giai đoạn cây con được thực hiện..
- Trong nghiên cứu này hệ thống giải trình tự thế hệ mới (NGS) Illumina Hiseq 2500 được sử dụng đã đọc được tổng số hệ gien biểu hiện từ ở giống Đốc Phụng, trong khi đó tổng số hệ gien được biểu hiện đọc được từ ở nếp Mỡ, tương tự (Bảng 1).
- Ở phân tích này, bộ gien của giống Nipponbare được sử sụng làm hệ gien tham chiếu, trong đó hệ gien biểu hiện trong nghiên cứu này khi so với hệ gien tham chiếu thì số lần gien biểu hiện từ 58 triệu đến 60 triệu gien, trong khi đó số gien biểu hiện mà không tìm thấy được trong bộ gien tham chiếu từ 6 triệu đến 7 triệu gien.
- Chất lượng trung bình của hệ gien biểu hiện đều >.
- 50 % (Bảng 1), chứng tỏ số lần đọc được của hệ gien biểu hiện đủ chất lượng để tiếp tục cho phân tích tiếp theo (Zhou et al.
- Tóm tắt tổng số hệ gien phiên mã so sánh với bộ gien tham chiếu bằng hệ thống Illumina So sánh hệ gien tham chiếu Đốc Phụng 12 giờ sau xử lý Nếp Mỡ 12 giờ sau xử lý.
- 0 mM NaCl 100 mM NaCl 0 mM NaCl 100 mM NaCl Tổng số hệ gien được đọc.
- Tổng số hệ gien biểu hiện đọc được.
- so với bộ gien tham chiếu Tổng số hệ gien biểu hiện gien.
- gien tham chiếu .
- Nhận diện mức độ biểu hiện khác nhau của hệ gien của mẫu sau xử lý mặn bằng RNA-seq.
- Mức độ biểu hiện gien có thể được xác định từ dữ liệu trình tự Illumina đọc được dựa trên số lần đếm được ban đầu (Bloom et al.
- mức độ gien biểu hiện (DEG) được xác định trong các điều kiện kiểm soát và xử lý stress bằng muối để nhằm tìm ra sự khác biệt về hệ phiên khi so sánh giữa các giống mang kiểu chịu đựng và mẫn cảm ở 12 giờ sau khi xử lý muối NaCl ở nồng độ 100 mM..
- 1596 unigen biểu hiện khác biệt so với nếp Mỡ chỉ có 427 unigen (Hình 1)..
- Biểu đồ Venn thể hiện unigen biểu hiện của giống Đốc Phụng và nếp Mỡ khi xử lý mặn.
- Khi phân tích bản thể học gien (GO) chỉ chon lọc các nhóm GO có ít nhất 3 gien biểu hiện trở lên và.
- 0.05 mới được xếp nhóm và so sánh giữa Đốc Phụng và nếp Mỡ ở giai đoạn 12 giờ sau khi xử lý mặn, trong giai đoạn này hầu hết các GO đều được xếp vào trong 3 nhóm chính đó là thành phần tạo nên tế bào (cellular components), chức năng phân tử (molecular function) và quá trình sinh học (biological process)..
- Nhìn chung tổng số gien biểu hiện ở ba nhóm chức năng của Đốc Phụng đều cao hơn nếp Mỡ khi gặp stress mặn, trong đó nhóm gien chức năng cấu phần tế bào, màng tế bào và nhóm gien mang chức năng phân tử biểu hiện cao nhất trong vai trò gắn kết các phân tử trong phản ứng hóa học.
- Trong khi đó chức năng quá trình sinh học nhóm gien được biểu hiện chỉ tập trung vào quá trình chất sinh hóa và quá trình tế bào (Hình 2).
- Trong khi nghiên cứu khả năng chụi mặn ở giống lúa Nhật Chilbo ở thời điểm 5 ngày sau xử lý mặn cho thấy hầu hết các nhóm gien biểu hiện đều thuộc trong chu trình tổng hợp chất sinh dưỡng (Metabolic process) (GO: GO:0006519) (Chandran et al.
- Nhóm gien biểu hiện được phân loại theo nhóm chức năng GO ở mẫu thí nghiệm..
- Phân tích chú giải bộ dữ liệu gen biểu hiện theo chức năng GO.
- Biểu đồ bong bóng cho thấy khác biệt ở mỗi giống có nhóm gen chức năng chuyên biệt phản ứng với stress sau khi xử lý muối với100 mM NaCl ở thời điểm 12 giờ (Hình 3).
- Đối với giống lúa Đốc.
- Phụng hầu hết các hệ gen biểu hiện giảm có ý nghĩa đều tập trung vào tiến trình sinh học với nhóm chức năng phản ứng kích hoạt (GO term: response to stimulus) và giảm sự biểu hiện nhiều nhất thuộc vào nhóm gen có chức năng phân tử, đặc biệt là nhóm gen liên quan đến yếu tố phiên mã (GO term:.
- mặn NM hầu hết các nhóm gien biểu hiện đều tăng và đều thuộc vào nhóm tiến trình sinh học với nhóm chức năng phản ứng kích hoạt (GO term: response to stimulus).
- nhau sẽ có phản ứng với stress mặn khác nhau và điều này giống như nghiên cứu trước đây (Hussain et al.
- Li et al.
- Biểu đồ bong bóng thể hiện các nhóm chức năng biểu hiện tăng và giảm khi xử lý mặn ở nồng độ muối NaCl 100 mM vào thời điểm 12 giờ sau khi xử lý.
- Thêm vào đó, dựa vào nhóm unigen được phân nhóm chức năng theo biểu đồ bong bóng, nhóm gien biểu hiện chức năng sinh học được phân tích mối liên kết đơn bằng phương pháp Singular Enrichment Analysis (SEA) được cung cấp bởi AgriGo V2 (Tian et al.
- 2017), phân tích này dựa vào bộ cơ sở dữ liệu 25.465 gen chức năng được công bố trên MSU Rice Genome Annotation (Kawahara et al.
- Nhìn chung cả Đốc Phụng và nếp Mỡ khi bị xử lý stress mặn điều biểu hiện nhóm gien chức năng liên quan đến quá trình sinh học tuy nhiên mức độ biểu hiện của hai kiểu gen khác nhau và điều liên quan đến chức năng phản ứng kích thích của stress.
- Tuy nhiên, mức độ phản ứng lại stress mặn ở hai kiểu gien có khác nhau.
- Tóm lại các gien biểu hiện có ý nghĩa trong nghiên cứu này khi gặp stress mặn điều liên quan đến nhóm gien yếu tố phiên mã và các chuyển hóa sinh học (Bảng 2).
- Kết quả này cũng tương tự như những nghiên cứu trước cho thấy yếu tố phiên mã đều liên quan trực tiếp đến phản ứng stress phi sinh học như hạn mặn như họ gien DREB (Moon et al.
- Wang et al.
- Phân tích Singular Enrichment Analysis (SEA) của ĐP và NM khi xử lý mặn ở nồng độ muối NaCl 100 mM vào thời điểm 12 giờ sau khi xử lý.
- Danh sách các gen được biểu hiện của Đốc Phụng và nếp Mỡ tại thời điểm 12 giờ sau xử lý 100 mM NaCl.
- Đốc Phụng 12 giờ sau xử lý mặn Nếp Mỡ 12 giờ sau xử lý mặn Mã số gien Tên gien Giảm Mã số gien Tên Gien tăng.
- Tóm lại, phản ứng của giống lúa Đốc Phụng khi gặp tác động của stress mặn ở giai đoạn sớm thì hầu hết nhóm gien biểu hiện đều liên quan quan đến phản ứng kích thích stress và chủ yếu là nhóm gien yếu tố phiên mã và các gien này biểu hiện lại giảm hơn so với đối chứng.
- Trong khi giống lúa nếp Mỡ thể hiện phản ứng lại stress mặn chủ yếu ở các gien liên quan đến quá trình sinh học.
- Nghiên cứu được tài trợ bởi dự án Nâng cấp Trường Đại học Cần Thơ VN14-P6 (vốn vay ODA từ Chính phủ Nhật Bản).
- Bloom, J.S., Khan, Z., Kruglyak, L., Singh, M., &.
- Bolser, D., Staines, D.M., Pritchard, E., &.
- Chandran, A.K.N., Kim, J-W., Yoo, Y-H., Park, H.L., Kim, Y-J., Cho, M-H., &.
- 10.1007/s .
- S., Zhou, Y., Chen, Y., &.
- 10.1093/bioinformatics/bty560.
- Hussain, S., Zhu, C., Bai, Z., Huang, J., Zhu, L., Cao, X., Nanda, S., Hussain, S., Riaz, A., Liang, Q., Wang, L., Li, Y., Jin, Q., &.
- Keel, B.N., &.
- 10.3389/fgen Kim, D., Langmead, B., &.
- 10.1093/bioinformatics/btr509.
- 10.1093/bioinformatics/btp352.
- 10.1186/s Liao, Y., Smyth, G.K., &.
- 10.1093/bioinformatics/btt656 Love, M.I., Huber, W., &.
- 10.1186/s .
- Shinozaki, K., &.
- 10.1093/jxb/erl164 Tam, N.T.
- Wang, J., Zhu, J., Zhang, Y., Fan, F., Li, W., Wang, F., Zhong, W., Wang, C., &.
- 10.1038/s w.
- Wang, Q., Guan, Y., Wu, Y., Chen, H., Chen, F., &.
- Zhou, Y., Yang, P., Cui, F., Zhang, F., Luo, X., &