- KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CAO CHIẾT CÂY NHÀU (MORINDA CITRIFOLIA L.) ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME GLUCOSE-6-PHOSPHATASE. - The objective is to estimate the activity of enzyme G-6-Pase in the liver and kidneys of diabetic mice treated by extracts of Morinda citrifolia L. - After 20 days, mice were taken liver and kidneys to evaluate enzyme G-6-Pase. - not only control blood glucose concentration in diabetic mice but also manage the excessive activity of enzyme G-6-Pase.. - Mục tiêu chính của nghiên cứu này là đánh giá khả năng hoạt động của enzyme G-6-Pase có trong gan và thận của chuột BTĐ được điều trị bằng cao chiết cây Nhàu (Morinda citrifolia L. - Chuột được gây BTĐ bằng alloxan monohydrate (AM) ở nồng độ 130 mg/kg trọng lượng chuột. - Sau đó, chuột được điều trị bằng cách cho uống cao chiết Nhàu và thuốc trị bệnh tiểu đường glucofast.. - Sau 20 ngày, gan và thận chuột được giải phẫu để khảo sát hoạt động của enzyme G-6-Pase. - Thực nghiệm đã chứng minh ngoài khả năng hạ đường huyết tương đương với thuốc glucofast, cao chiết Nhàu còn có tác dụng trong việc kiểm soát hoạt động quá mức của enzyme G-6-Pase ở những con chuột BTĐ.. - Kết quả sự can thiệp của các thảo dược đến hoạt động của các enzyme biến dưỡng carbohydrate là sự duy trì lượng glucose trong máu ở mức bình thường (Balakrishnan et al., 2009). - 2.2.2 Khảo sát hoạt động enzyme glucose-6- phosphatase ở gan và thận chuột. - Chuột nhắt trắng khỏe mạnh (21 con) có nồng độ đường huyết trung bình từ mg/dl được tiêm dung dịch alloxan monohydrate ở nồng độ 130 mg/kg trọng lượng chuột để gây BTĐ. - Sau khi chuột BTĐ ổn định 7 ngày, chuột BTĐ được cho uống thuốc điều trị glucofast (150 mg/kg trọng lượng chuột) hoặc cao ethanol từ các bộ phận của cây Nhàu trong 20 ngày. - Liều lượng cao chiết sử dụng để điều trị BTĐ cho chuột là ngày uống hai lần, mỗi lần 200 mg/kg trọng lượng chuột được pha trong 0,1 ml nước cất. - Sau 20 ngày chuột BTĐ được điều trị bệnh, chuột được cho nhịn đói qua đêm, sau đó gan và thận của chuột được sử dụng để khảo sát hoạt động của enzyme G-6-Pase.. - Gan (hoặc thận) sau khi giải phẫu được lấy 500 mg và nghiền trong l ml dung dịch đệm sucrose lạnh nồng độ 0,25 M, pH = 6,5. - Phần dịch nổi ở trên được sử dụng cho việc nghiên cứu hoạt động của enzyme G-6-Pase.. - Hoạt động của enzyme G-6-Pase được thực hiện theo quy trình của Punitha et al. - (2005) có hiệu chỉnh như sau 100 µl dịch gan (hoặc thận) được thêm vào hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl dung dịch sucrose/EDTA nồng độ 0,1 M pH µl G-6-P 0,1 M pha trong dung dịch đệm citrate nồng độ 0,1 M pH µl dung dịch đệm citrate nồng độ 0,1 M pH = 6,5.. - Cuối cùng, lượng phosphate vô cơ được tạo ra dưới sự xúc tác của enzyme G-6- Pase sẽ được phát hiện ở bước sóng 700 nm bằng phương pháp so màu máy đo quang phổ.. - Hoạt động của enzyme G-6-Pase được đánh giá dựa vào khả năng tạo ra gốc phosphate vô cơ trong phản ứng. - Nồng độ phosphate được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Khảo sát hoạt động của enzyme glucose- 6-phosphatase trong gan chuột. - Cơ chế cơ bản của tăng đường huyết trong BTĐ thường liên quan đến sự mất cân đối của. - Enzyme G-6-Pase là một trong những enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate (Lee et al., 2007).. - Enzyme G-6-Pase có vai trò xúc tác thủy phân glucose-6-phosphate thành glucose và gốc phosphate vô cơ (Froissart et al., 2011). - Trong phần này hoạt động của enzyme G-6-Pase trên chuột bình thường uống cao chiết Nhàu và nhóm chuột BTĐ được điều trị bằng cao chiết Nhàu được khảo sát dựa vào khả năng tạo ra gốc phosphate vô cơ sau phản ứng thủy phân G-6-P của enzyme G-6-Pase. - Nồng độ phosphate được tính dựa theo phương trình đường chuẩn y = 0,0071x + 0,1911 (R 2 =0,9706). - Kết quả về nồng độ phosphate vô cơ được trình bày ở Bảng 1 (chuột bình thường uống cao chiết Nhàu) và Bảng 2 (chuột BTĐ uống cao chiết Nhàu).. - Bảng 1 : Nồng độ phosphate vô cơ được chuyển hóa do enzyme glucose-6-phosphatase có trong gan chuột bình thường uống cao Nhàu. - Nghiệm thức Nồng độ đường huyết (mg/dl) Nồng độ phosphate vô cơ (×10 -9 pM). - Bình thường 133,33 a c ± 2,27. - Cao chiết cây Nhàu đã được chứng minh không gây độc trên chuột bình thường trong 20 ngày thử độc bằng cách cho chuột bình thường uống cao ethanol từ các bộ phận của cây Nhàu (Nguyễn Thị Mai Phương, 2012).. - Kết quả ghi nhận được (Bảng 1) cho thấy nồng độ phosphate vô cơ được chuyển hóa sau phản ứng thủy phân G-6-P ở nhóm chuột bình thường uống cao lá là cao nhất pM. - Chuột uống cao trái chín có lượng phosphate vô cơ được chuyển hóa ở gan. - Kết quả phân tích thống kê cho thấy nồng độ phosphate được chuyển hóa ở gan giữa nhóm chuột bình thường so với bốn nghiệm thức chuột sử dụng cao chiết Nhàu khác biệt có ý nghĩa thống kê. - Chuột sau 20 ngày uống cao chiết Nhàu, đường huyết dao động từ mg/dl, sự thay đổi này không có ý nghĩa thống kê so với trước khi cho uống các cao chiết Nhàu. - Nói cách khác, cao chiết Nhàu không làm ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme G-6-Pase trong gan chuột bình thường trong suốt thời gian thí nghiệm.. - Bảng 2: Nồng độ phosphate vô cơ được chuyển hóa do enzyme glucose-6-phosphatase có trong gan chuột BTĐ điều trị bằng cao chiết Nhàu. - Bình thường 132,67 b g ± 0,52. - Kết quả theo dõi tác dụng hạ đường huyết của nhóm chuột BTĐ điều trị bằng glucofast đã chứng minh đây là nhóm có mức đường huyết giảm nhiều nhất từ xuống còn với tỷ lệ giảm tương đương 69,54%. - Xét khả năng kiểm soát hoạt động của enzyme G-6-Pase trong gan chuột thì glucofast vẫn được đánh giá khá cao với lượng phosphate đo được sau điều trị là pM.. - Kết quả này tuy có khác biệt so với nghiệm thức chuột bình thường nhưng vẫn thấp hơn đáng kể so với nhóm chuột bệnh không được điều trị pM).. - Sau 20 ngày trị bệnh, đường huyết của chuột BTĐ uống cao rễ và cao trái chín lần lượt giảm còn và tương ứng giảm 50% so với trước khi điều trị. - Nồng độ phosphate vô cơ được chuyển hóa do hoạt động của enzyme G-6-Pase có trong gan của chuột BTĐ sau 20 ngày uống cao rễ Nhàu là pM, cao trái chín là pM thấp hơn rất nhiều so với nhóm chuột BTĐ không được điều trị có nồng độ phosphate vô cơ là pM. - Điều này chứng minh cao rễ và cao lá có khả năng giữ glucose trong máu ở mức ổn định thông qua việc duy trì hoạt động bình thường của enzyme G-6-Pase.. - Lượng phosphate đo được ở nhóm chuột BTĐ uống cao lá Nhàu là pM , cao trái xanh là pM. - Kết quả thí nghiệm đã chứng minh cao chiết lá và trái. - xanh của Nhàu cũng có khả năng làm giảm hoạt động quá mức của enzyme G-6-Pase trong gan chuột BTĐ một cách có ý nghĩa thống kê so với chuột BTĐ không được điều trị bệnh. - Tỷ lệ hạ đường huyết của nhóm chuột điều trị bằng cao chiết trái xanh và cao lá tuy thấp hơn so với 3 nhóm nghiệm thức uống glucofast, cao rễ và cao trái chín nhưng kết quả này vẫn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chuột không điều trị. - Chuột BTĐ không được điều trị bằng thuốc glucofast hoặc cao chiết Nhàu chết rất nhanh, thường sau 5 đến 9 ngày tính từ khi bắt đầu bị BTĐ.. - Kết quả này một lần nữa khẳng định sản phẩm sau phản ứng thủy phân G-6-P càng nhiều thì khả năng hoạt động của G-6-Pase càng cao là một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng tăng đường huyết quá mức ở chuột. - Điều này chứng tỏ có mối tương quan giữa tình trạng bệnh và hoạt động của enzyme G-6-Pase. - Trong bốn cao chiết được sử dụng trong nghiên cứu thì cao chiết rễ có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất (nồng độ đường huyết thấp nhất), nồng độ phosphate đo được là thấp nhất. - Ngược lại, cao chiết lá tác dụng hạ đường huyết thấp nhất trong bốn loại cao, nồng độ phosphate vô cơ đo được trong gan là cao nhất. - Mối tương quan giữa đường huyết và nồng độ phosphate vô cơ được chuyển hóa ở gan chuột được trình bày ở Hình 1.. - Hình 1: Nồng độ phosphate vô cơ được chuyển hóa do enzyme G-6-Pase có trong gan chuột. - Tóm lại, bốn loại cao chiết Nhàu đều có tác dụng làm giảm sự hoạt động của enzyme G-6- Pase ở gan của chuột BTĐ. - Điều này cho thấy đây là một trong những cơ chế ổn định đường huyết của chuột BTĐ khi sử dụng cây Nhàu để hỗ trợ điều trị bệnh.. - 3.2 Khảo sát hoạt động của enzyme glucose- 6-phosphatase trong thận chuột. - Hoạt động của enzyme G-6-Pase ở thận của chuột bị BTĐ được điều trị bằng các cao chiết Nhàu và chuột bình thường uống cao chiết được tiến hành tương tự như phần khảo sát enzyme G-6-Pase trong gan đã trình bày ở trên. - Kết quả về nồng độ phosphate vô cơ được tạo thành do hoạt động của enzyme G-6-Pase được trình bày ở Bảng 3 (chuột bình thường uống cao chiết) và Bảng 4 (chuột BTĐ uống cao chiết).. - Kết quả được trình bày ở bảng 3 cho thấy, đối với nhóm chuột bình thường uống cao chiết nồng độ phosphate vô cơ được tạo ra do hoạt động của enzyme G-6-Pase trong thận của nhóm nghiệm thức cao lá và nhóm nghiệm thức. - Kết quả này phù hợp với kết quả của phần khảo sát enzyme G-6-Pase trong gan. - Lượng phosphate vô cơ được chuyển hóa ở nhóm chuột uống cao lá và cao trái xanh cũng cao hơn so với các nhóm nghiệm thức còn lại. - Tuy nhiên kết quả chứng minh không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm nghiệm thức này với nhóm chuột không uống cao. - Riêng nhóm chuột uống cao rễ và cao trái chín có lượng phosphate được tạo ra ở thận khoảng 12×10 -9 pM tương đương với kết quả của nhóm chuột bình thường . - Thêm vào đó, kết quả theo dõi đường huyết của năm nhóm nghiệm thức này cho thấy đường huyết chuột vẫn duy trì ở mức bình thường. - Điều này cho thấy enzyme G-6- Pase vẫn hoạt động bình thường và glucose trong máu được giữ ở mức ổn định. - Từ đây có thể đưa ra kết luận rằng trong 20 ngày thí nghiệm, cao chiết Nhàu không làm ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme G-6-Pase trong thận của chuột bình thường.. - Bảng 3: Nồng đồ phosphate vô cơ được chuyển hóa do enzyme glucose-6-phosphatase có trong thận chuột bình thường uống cao Nhàu. - Bình thường 133,33 a a ± 1,27. - Kết quả về nồng độ phosphate được tạo thành sau phản ứng thủy phân glucose 6 phosphate của enzyme G-6-Pase được trình bày trong bảng 4. - Xét đến nghiệm thức chuột BTĐ được cho uống thuốc glucofast, kết quả cho thấy đường huyết của chuột giảm đáng kể từ mg/dl xuống mg/dl tương đương giảm 67,65% sau 20 ngày điều trị. - Nồng độ phosphate vô cơ ở nhóm chuột này là pM. - Qua đây cho thấy glucofast không chỉ giúp làm hạ đường huyết của chuột mà còn có khả năng làm giảm hoạt động quá mức của enzyme G-6-Pase ở chuột bị BTĐ.. - Đường huyết sau điều trị của chuột BTĐ uống cao rễ Nhàu là mg/dl. - Cao rễ Nhàu cũng có khả năng làm giảm hoạt tính của enzyme G-6-Pase với lượng phosphate vô cơ sau điều trị là pM. - Kết quả này tương tự như ở nhóm uống cao trái chín với mức phosphate đo được là pM, không có khác biệt so với lượng phosphate của nhóm glucofast. - Điều này chứng tỏ khả năng hạ đường huyết và kiểm soát hoạt động của enzyme G-6-Pase của cao rễ Nhàu và cao trái xanh là tương đương với thuốc glucofast điều trị BTĐ.. - Đối với nhóm chuột BTĐ được điều trị bằng cao lá và cao trái xanh Nhàu thì đường huyết vẫn còn cao hơn so với các nghiệm thức khác.. - 1,57×10 -9 pM, và thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm BTĐ không được điều trị pM). - Dựa trên kết quả phân tích cho thấy cao lá và cao trái xanh cũng có khả năng làm hạ đường huyết và làm giảm lượng phosphate vô cơ được tạo ra ở thận. - Cuối cùng là nhóm chuột BTĐ không được điều trị với nồng độ phosphate cao nhất là 48,30. - Kết quả này phù hợp với lý thuyết về hoạt động của enzyme G-6-Pase ở thận và phù hợp với kết quả nghiên cứu của Zhao et al. - Hoạt động của G-6-Pase tăng lên đáng kể ở chuột bị BTĐ, dẫn đến lượng glucose dư thừa trong máu tăng quá cao và kéo theo nhiều biến chứng khác của BTĐ và cuối cùng là sự chết của chuột vài ngày sau đó.. - Mối tương quan giữa mức độ hoạt động của enzyme G-6-Pase và đường huyết sau điều trị của các nhóm chuột được trình bày trong hình 2 cho thấy có sự tương quan thuận giữa đường huyết và hoạt động của enzyme G-6-Pase.. - Trong bốn loại cao chiết thử nghiệm cao chiết rễ và cao trái chín có tác dụng hạ đường huyết và kiểm soát hoạt động enzyme G-6-Pase tốt hơn so với cao chiết lá và cao trái xanh của cây Nhàu.. - Từ tất cả các kết quả đã được trình bày trong nghiên cứu này cho thấy cao chiết từ các bộ phận của cây Nhàu có khả năng kiểm soát hoạt động quá mức của enzyme G-6-Pase trong gan và thận chuột từ đó làm hạ đường huyết ở chuột BTĐ. - Kết quả nghiên cứu này cũng chứng minh tiềm năng của các cao chiết Nhàu trong hỗ trợ điều trị BTĐ là đáng quan tâm.. - Bảng 4: Nồng độ phosphate vô cơ được chuyển hóa do enzyme glucose-6-phosphatase có trong thận chuột BTĐ điều trị bằng cao chiết Nhàu. - Nghiệm thức Nồng độ đường huyết (mg/dl) Nồng độ phosphate vô cơ (×10 -9 pM) Bình thường 132,67 b e ± 2,07 Không trị bệnh 321,33 a a ± 3,37 Glucofast 154,33 ab d ± 3,32. - Hình 2: Nồng độ phosphate vô cơ được chuyển hóa do enzyme G-6-Pase có trong thận chuột. - Bốn loại cao chiết Nhàu đều có tác dụng làm giảm hoạt tính của enzyme glucose-6- phosphatase có ở gan và thận chuột bệnh tiểu đường. - Kết quả của việc điều hòa hoạt động của enzyme glucose-6-phosphatase là sự ổn định đường huyết sau 20 ngày chuột bệnh tiểu đường được điều trị.. - Tác động hạ đường huyết và điều hòa hoạt động của enzyme glucose-6-phosphatase của cao rễ và cao trái chín Nhàu tương đương với thuốc trị bệnh tiểu đường glucofast.. - Xác định thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết có tác dụng hạ đường huyết.. - Tiếp tục nghiên cứu cơ chế hạ đường huyết của các cao chiết trái chín, rễ Nhàu trên mô hình chuột bệnh tiểu đường.. - Khảo sát khả năng hạ đường huyết và chống oxy hóa của cao chiết cây nhàu (Morinda citrifolia L.) ở chuột bệnh tiểu đường