- KHẢO SÁT BỆNH VIÊM PHỔI, MÀNG PHỔI DO VI KHUẨN Actinobacillus pleuropneumoniae TRÊN HEO TẠI TỈNH BẾN TRE Phan Kim Thanh 1. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát sự lưu hành, xác định serotype và kiểm tra sự nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) gây bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo tại tỉnh Bến Tre. - Các serotype vi khuẩn APP được xác định và định danh dựa vào gene độc tố apx từ 114 mẫu dịch xoang mũi, 15 mẫu hạch hạnh nhân và 15 mẫu phổi heo ở các lứa tuổi tại các trại, hộ chăn nuôi và lò giết mổ gia súc tại tỉnh Bến Tre bằng phương pháp PCR, kiểm tra sự nhạy cảm kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. - Kết quả cho thấy tỷ lệ bệnh hô hấp trên heo tại tỉnh Bến Tre là 11,52%. - Tỷ lệ phân lập được vi khuẩn Actinobacillus spp. - Trong 16 chủng vi khuẩn APP phân lập được có 5 chủng thuộc serotype 4. - Vi khuẩn APP gây bệnh viêm phổi, màng phổi nhạy cảm với kháng sinh amoxicillin/clavulanic acid (100. - Khảo sát bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae trên heo tại tỉnh Bến Tre. - Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) là một trong những nguyên nhân gây bệnh viêm phổi, màng phổi cho tất cả các lứa tuổi heo trên toàn thế giới. - (2016), vi khuẩn APP gây ra bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo có 15 serotype khác nhau.. - (2012), Nguyễn Quốc Huy và ctv.(2013) nghiên cứu từ những mẫu bệnh phẩm ở heo dương tính với virus PRRS tại Bắc Giang đã cho kết quả 19,59% và 17,78% số mẫu được phân lập dương tính với vi khuẩn APP.. - Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu về tỷ lệ heo bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn APP, định danh các serotype của vi khuẩn APP và kiểm tra sự nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn APP phân lập được trên heo tại tỉnh Bến Tre được thực hiện.. - Primer mã hoá gene độc tố apxIVA, apxICA, apxIICA, apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD (Bioline, USA) dùng xác định và định danh các serotype của vi khuẩn APP bằng phương pháp PCR (Frey et al., 2002. - Heo được chọn lấy mẫu đại diện cho ô chuồng, có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn APP gây ra như thở khó dữ dội, ngồi thở hoặc nằm thở, vùng da tai tím tái, phổi và hạch hạnh nhân xuất huyết viêm dính, chảy máu mũi trước khi chết. - 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Mẫu dịch xoang mũi, phổi và hạch hạnh nhân được nuôi cấy, phân lập trên môi trường thạch chocolate, đem ủ trong điều kiện 5-10% CO 2 ở 37 o C trong 24-48 giờ (Quinn et al., 2004). - Quan sát các khuẩn lạc vi khuẩn APP trên môi trường thạch chocolate nhỏ 0,5-1 mm, màu xám, trong mờ và trơn nhẵn (Pozzi et al., 2011).. - 2.2.3 Phương pháp xác định và định danh các serotype của vi khuẩn APP. - Ly trích DNA của vi khuẩn. - DNA của vi khuẩn APP được ly trích theo phương pháp shock nhiệt của Kucerova et al.. - Sau khi tăng sinh vi khuẩn APP trên môi trường chocolate, thu sinh khối vi khuẩn cho vào ống eppendorf có chứa 0,5 ml nước cất vô trùng, lắc đều rồi đun cách thủy ở 100 o C trong 10 phút.. - Xác định vi khuẩn APP bằng kỹ thuật PCR Xác định vi khuẩn APP dựa vào gene độc tố apxIVA bằng phương pháp PCR theo Rayamajhi et al. - Định danh các serotype của vi khuẩn APP bằng phương pháp PCR. - Định danh các serotype của vi khuẩn APP bằng. - Bảng 2: Trình tự primer của các cặp đoạn mồi dùng xác định và định danh các serotype của vi khuẩn APP bằng phương pháp PCR (Frey et al., 2002). - Kết quả sau khi điện di sẽ được đối chiếu sự hiện diện của các gene apx trong Bảng 3 để định danh serotype của vi khuẩn APP.. - Bảng 3: Sự hiện diện của các gene apx trong các serotype khác nhau của vi khuẩn APP (Rayamajhi et al., 2005). - 2.2.4 Phương pháp kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn APP đối với kháng sinh. - Kiểm tra sự nhạy cảm của vi khuẩn APP với kháng sinh được thực hiện theo phương pháp. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh hô hấp trên heo tại tỉnh Bến Tre. - Bảng 4: Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh hô hấp trên heo tại tỉnh Bến Tre. - Tỷ lệ. - Bến Tre . - và cao hơn kết quả nghiên cứu của Pozzi et al.(2011) là 8%. - 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn. - trên heo bị bệnh hô hấp tại tỉnh Bến Tre. - Kết quả phân lập v i khuẩn Actinobacillus spp.. - nhiễm vi khuẩn Actinobacillus spp. - Quinn et al.(2004) đã nhận định vi khuẩn Actinobacillus spp. - Do đó, kết quả tỷ lệ nhiễm Actinobacillus spp. - Bảng 5: Kết quả phân lập vi khuẩn Actinobacillus spp. - trên heo bệnh hô hấp tại tỉnh Bến Tre. - 3.3 Kết quả xác định vi khuẩn APP dựa vào gene apxIVA bằng kỹ thuật PCR. - Tiến hành xác định vi khuẩn APP dựa vào gene apxIVA từ 65 mẫu dương tính với Actinobacillus spp., kết quả được trình bày qua Bảng 6.. - Bảng 6: Kết quả xác định vi khuẩn APP dựa vào gene apxIVA. - Hai huyện Mỏ Cày Nam và Chợ Lách có tỷ lệ dương tính với vi khuẩn APP cao và tương đương nhau lần lượt là 32,14% và 33,33% (P =0,814), và thấp nhất là thành phố Bến Tre (5,56. - Vi khuẩn APP hiện diện đều khắp ở những trại chăn nuôi có heo bị bệnh hô hấp tại tỉnh Bến Tre. - trong tổng số 50 đàn được kiểm tra dương tính với vi khuẩn APP. - (2013) nghiên cứu tại Aguascalientes - Mexico đã cho kết quả có 20% số mẫu dương tính với vi khuẩn APP. - Điều này cho thấy APP là vi khuẩn phổ biến gây bệnh đường hô hấp trên heo tại Việt Nam và các quốc gia khác trên thế giới cũng như tại các khu vực có địa lý, thổ nhưỡng, khí hậu khác nhau thì tỷ lệ nhiễm APP trên heo cũng khác nhau.. - Hình 1: Sản phẩm PCR của gene apxIVA của vi khuẩn APP sau quá trình điện di Giếng 1: Marker (3000bp). - giếng 8: dương tính (2.000bp) Bảng 7: Kết quả tỷ lệ heo bệnh viêm phổi, màng. - phổi do vi khuẩn APP tại tỉnh Bến Tre theo phương thức nuôi. - Ở kết quả nghiên cứu này, tỷ lệ lưu hành của vi khuẩn APP ở những đàn heo được nuôi theo phương thức hộ gia đình cao hơn trang trại, tỷ lệ lần lượt là 29,73% và 17,86%. - Điều này có thể là do vi khuẩn APP trong môi trường nuôi tại các hộ gia đình và trang trại có sự phân bố giống nhau. - (2002) cho rằng vi khuẩn APP thường có ở đường hô hấp trên của heo và dễ dàng gây bệnh cho heo khi gặp điều kiện môi trường bất lợi, điều này có thể làm cho tỷ lệ nhiễm vi khuẩn APP trong phương thức nuôi hộ gia đình và trang trại không có sự khác nhau. - Bảng 8: Kết quả tỷ lệ heo bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn APP tại tỉnh Bến Tre theo lứa tuổi. - Kết quả ở Bảng 8 cho thấy tỷ lệ heo nhiễm bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn APP là tương đương nhau và sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (P=0,685). - Trong nghiên cứu này, heo ở cả 3 nhóm tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn APP là tương đương nhau.. - Bảng 9: Kết quả tỷ lệ heo bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn APP tại tỉnh Bến Tre theo loại bệnh phẩm. - Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn APP trên ba loại mẫu bệnh phẩm dịch xoang mũi, phổi và hạch hạnh nhân được trình bày ở Bảng 9 là tương đương nhau (25,45%. - (2002) đã nhận định rằng vi khuẩn APP thường có ở đường hô hấp trên, đặc biệt là ở trong xoang mũi và hạch hạnh nhân. - (2012) về sự hiện diện của vi khuẩn APP trong dịch hầu họng ở heo bệnh tại Australia cho kết quả khá thấp, chỉ chiếm 4%. - Điều này có thể do sự khác biệt về phương thức chăn nuôi của từng vùng, mầm bệnh hiện diện trong môi trường chăn nuôi lan truyền trực tiếp từ heo bệnh sang heo khỏe, vi khuẩn APP khu trú ở các cơ quan xoang mũi, phổi và hạch hạnh nhân là phổ biến hơn bệnh phẩm ở các vị trí khác và có tỷ lệ nhiễm không khác nhau.. - Bảng 10: Kết quả khảo sát tần suất xuất hiện các triệu chứng gây bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn APP tại Bến Tre (n=16) Triệu chứng Số trường hợp. - (2012), Mark (2016) hiện tượng heo sốt cao, thở khó, ho, ủ rũ, bỏ ăn, ít đi lại, chảy nước mũi, chảy máu mũi trước khi chết là những biểu hiện đặc trưng của bệnh viêm phổi, màng phổi do vi khuẩn APP. - (2002), vi khuẩn APP xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua đường hô hấp, chúng tiếp tục đi qua. - Tại đây, lipopolysaccharide (LPS) và ngoại độc tố của vi khuẩn APP giết chết đại thực bào và bạch cầu trung tính gây nên quá trình viêm. - 3.4 Kết quả định danh các serotype vi khuẩn APP gây bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo tại Bến Tre. - Sự lưu hành của các serotype vi khuẩn APP phổ biến trên heo ở tỉnh Bến Tre cũng được định danh với tỷ lệ khác nhau, kết quả được trình bày tại Bảng 11.. - Bảng 11: Kết quả định danh các serotype vi khuẩn APP gây bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo tại Bến Tre (n=16) Serotype Số lượng (mẫu) Tỷ lệ. - P=0,003 Các serotype 4, 6, 9 và 11 của vi khuẩn APP gây bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo tại tỉnh Bến Tre phân bố khác nhau và sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (P=0,003). - Điều này đã chỉ ra rằng các serotype vi khuẩn APP phân lập được tại tỉnh Bến tre đa dạng và không đồng đều.. - (2009) nghiên cứu về serotype của vi khuẩn APP tại các tỉnh Miền Bắc và Nguyễn Lương Trường Giang (2015) nghiên cứu tại thành phố Cần Thơ đã cho kết quả các serotype 2, 5 của vi khuẩn APP là phổ biến ở những địa phương này.. - Từ những kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy các serotype của vi khuẩn APP gây bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo xuất hiện ngày càng đa dạng, cần được quan tâm nghiên cứu thường xuyên.. - Hình 6: Sản phẩm PCR của gene apxIIIBD (968bp) của vi khuẩn APP sau quá trình điện di Giếng 1: Marker (3.000bp). - 3.5 Kết quả kiểm tra sự nhạy cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn APP phân lập được. - Sau khi xác định vi khuẩn APP, tiến hành kiểm tra sự nhạy cảm của vi khuẩn APP với một số loại kháng sinh theo phương pháp khuếch tán trên thạch. - Qua kết quả kiểm tra cho thấy vi khuẩn APP còn nhạy cảm cao với amoxicillin/clavulanic acid (100. - Sự nhạy cảm của vi khuẩn APP với một số loại kháng sinh trong nghiên cứu này cho kết quả tương tự với kết quả báo cáo của Nguyễn Thị Thu Hằng (2010) khi kiểm tra vi khuẩn APP nhạy cảm với Hình 2: Sản phẩm PCR của gene apxICA. - (2.420bp) của vi khuẩn APP sau quá trình điện di Giếng 1: Marker (3.000bp). - Hình 3: Sản phẩm PCR của gene apxIBD (1.447bp) của vi khuẩn APP sau quá trình điện di Giếng 1: Marker (3.000bp). - Hình 4: Sản phẩm PCR của gene apxIICA (2.088bp) của vi khuẩn APP sau quá trình điện di Giếng 1: Marker (3.000bp). - Hình 5: Sản phẩm PCR của gene apxIIICA (1.755bp) của vi khuẩn APP sau quá trình điện di Giếng 1: Marker (3.000bp). - kháng sinh ceftriaxone, ampicillin, amoxicillin tại một số tỉnh phía Bắc và Nguyễn Lương Trường Giang (2015) tại Cần Thơ vi khuẩn APP còn nhạy cảm cao với amoxicillin/clavulanic acid. - (2016) cho thấy vi khuẩn APP đề kháng với ampicillin và norfloxacin.. - Bảng 12: Kết quả kiểm tra sự nhạy cảm của vi khuẩn APP phân lập được với một số loại kháng sinh (n=16). - Bảng 13: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn APP phân lập được với một số loại kháng sinh (n=16). - Số chủng vi khuẩn đề kháng. - Vi khuẩn APP phân lập được đều đa kháng từ 4 đến 9 loại kháng sinh. - Sự đa kháng của vi khuẩn APP phân lập được với các loại kháng sinh trong nghiên cứu này cho thấy sự đa kháng là phức tạp và đa dạng. - Kết quả kiểm tra sự đa kháng kháng sinh của 16 chủng vi khuẩn APP cho thấy có sự đa dạng và phức tạp của các serotype, đặc biệt là trong cùng một serotype nhưng lại có nhiều kiểu hình đa kháng khác nhau. - Từ đó đặt ra việc nghiên cứu vaccine phòng bệnh phù hợp với các serotype của vi khuẩn APP là điều rất cần thiết, nhất là trong thời điểm vi khuẩn APP ngày càng kháng nhiều loại kháng sinh cùng lúc như hiện nay và việc điều trị bằng kháng sinh đang gặp nhiều khó khăn và kém hiệu quả.. - Bảng 14: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các serotype vi khuẩn APP phân lập được với một số loại kháng sinh. - vi khuẩn đề kháng. - Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn APP gây bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo tại tỉnh Bến Tre là 24,62%. - Vi khuẩn APP hiện diện không phụ thuộc vào lứa tuổi, phương thức nuôi và loại bệnh phẩm. - Có 4 serotype vi khuẩn APP gây bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo được định danh tại tỉnh Bến Tre là serotype 4, 6, 9 và 11. - Vi khuẩn APP phân lập được nhạy cảm với amoxicillin/clavulanic acid, tulathromycin, gentamicin. - Khảo sát sự lưu hành và xác định gene độc lực apx của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây bệnh viêm phổi, màng phổi trên heo tại thành phố Cần Thơ.. - Ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định độc tố (Apx) có trong vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập từ heo bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam