- KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG SỐT RÉT CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG. - pentandra extracts is 2 mg/ml. - T.crispa methanol extract inhibit BH formation at concentrations of 1, 0.5 and 0.25 mg/ml. - sarmentosum methanol extract was inhibited heme converts to BH at 0.25 mg/ml. - pellucida extract showed the activity of various concentrations and 0.25 mg/ml). - pellucida extract was 0.8 mg/ml. - longifolia), Càng cua (P.pellucida), dây Cóc (T. - Cao methanol trích từ tám cây này được đánh giá khả năng kháng sốt rét thông qua sự ức chế sự tổng hợp β-hematin (BH) in vitro. - Kết quả cho thấy, cao methanol từ cây Gòn, Chó đẻ thân hồng, Chó đẻ thân xanh có khả năng ức chế sự tổng hợp BH ở nồng độ cao methanol là 2 mg/ml. - Cao methanol từ dây Cóc có ức chế sự biến đổi heme thành BH ở nồng độ cao là 1, 0,5 và 0,25 mg/ml. - Cao methanol từ cây Lốt ức chế sự biến đổi heme thành BH nồng độ cao 0,25 mg/ml. - Mẫu cao từ cây Càng cua có hoạt tính ức chế sự hình thành BH ở các nồng độ cao 2, 1, 0,5 và 0,25 mg/ml. - IC 50 của cao methanol ở cây Càng cua là 0,8 mg/ml. - Cao methanol của cây Càng cua được tách phân đoạn thành cao nước, cao diethyl ether và cao nước được tách phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). - Tất cả các phân đoạn và các phân đoạn HPLC của cây Càng cua được khảo sát khả năng kháng sốt rét ở mức độ in vitro và mức độ tế bào. - Sáu phân đoạn của cao nước sau khi tách bằng HPLC được chứng minh có khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH có ý nghĩa thống kê.. - Càng cua. - Sự kháng rất nhanh của ký sinh trùng sốt rét đối với những thuốc có nhóm quinoline như quinine và chloroquine là vấn đề rất khó khăn cho việc kiểm soát và tìm ra thuốc để điều trị bệnh này (Trigg et al., 1998). - Giai đoạn ký sinh trong tế bào hồng cầu của người hoặc động vật, ký sinh trùng sốt rét sử dụng nguồn acid amin từ sự thủy phân hemoglobin. - Để tránh sự tổn thương do nhóm heme tự do gây ra, ký sinh trùng sốt rét biến đổi heme thành những chất không gây độc. - Nhiều nghiên cứu cho thấy, hơn 90% heme được kết tinh thành hemozoin (HZ) hay còn gọi là -hematin (BH), một chất không tan trong nước được tạo thành trong không bào tiêu hóa của ký sinh trùng sốt rét. - Hiện nay đã được biết cơ chế khử độc heme là duy nhất và chuyên biệt đối với ký sinh trùng sốt rét (Sullivan et al., 1996).. - Nhiều cây cỏ ở Việt Nam đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum 3D7 in vitro như: cây Gòn (Ceiba pentandra (L.) Gaertn. - (Quan et al., 2003) Dịch chiết từ Tinospora crispa được cho là có khả năng kháng ký sinh trùng sốt rét (Hasimah et al., 1991).. - Chúng tôi đã tìm và chứng minh một số cây thuốc ở ĐBSCL có hoạt tính kháng sốt rét thông qua sự ức chế quá trình biến đổi heme thành -hematin (BH).. - Sau khi cô quay chúng tôi thu được cao chiết từ dung môi methanol dưới dạng tổng (gọi là cao methanol), các mẫu cao chiết này được trữ trong tủ lạnh ở ngăn đá để sử dụng cho các thí nghiệm sau này. - Cao methanol của những cây có hoạt tính kháng sốt rét được tiếp tục trích để tách các chất ưa nước và kỵ nước bằng cách hòa cao methanol trong nước và tách bằng hai pha lỏng–lỏng gồm nước và diethyl ether.. - Sau khi cô quay thu được cao nước và cao diethyl ether, các cao này được sử dụng để xác định khả năng ức chế phản ứng kết tinh heme thành BH.. - Tách các hợp chất có hoạt tính trong cao chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng. - Cao nước của cây Càng cua được pha loãng trong nước sau đó được lọc qua giấy lọc cellulose acetate hydrophilic (DISMIC-25CS) đường kính 0,2 µm tách các chất bằng phương pháp HPLC.. - 2.2.3 Phản ứng ức chế sự biến đổi heme thành BH. - Phản ứng tổng hợp BH được thực hiện theo phương pháp của Egan et al. - Orjih (2001) và Trang et al. - Khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH của cao nước, cao diethyl ether và các phân đoạn sau khi tách bằng HPLC được thực hiện theo phương pháp của Huy et al. - Tỷ lệ heme biến đổi thành BH được tính theo công thức và phần trăm ức chế phản ứng biến đổi heme thành BH của thuốc hoặc các cao chiết tính theo Huy et al.. - A control : giá trị đo được của heme khi không có Tween 20, không có thuốc hoặc các cao chiết.. - A sample : giá trị đo được của heme khi có Tween 20, và thuốc hoặc các cao chiết.. - A min : giá trị đo được của heme và Tween 20 khi không có thuốc hoặc các cao chiết.. - 2.2.4 Phản ứng ức chế sự tổng hợp BH của các cao chiết và các phân đoạn HPLC ở mức độ tế bào. - Tế bào hồng cầu người được nuôi trong môi trường RPMI 1640 (Sigma) bổ sung thêm 0,025 mg/ml gentamicin, 0,01 mM hypoxanthine, 23,8 mM NaHCO 3 , 0,5%. - Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của của các phân đoạn cao chiết Càng cua gồm cao methanol, cao nước, cao diethyl ether và các phân đoạn của cao nước sau khi được phân tách bằng HPLC ở mức độ tế bào. - ức chế = 100 × (A sample – A min. - falciparum K1 nồng độ 1,5% (parasited red blood cell, pRBC) được ủ với thuốc quinine như mẫu đối chứng dương, và 10 µl của các cao thí nghiệm, mẫu đối chứng âm được ủ trong điều kiện không có thuốc. - 3.1 Sự ức chế biến đổi heme thành BH của các cao methanol. - Khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH của tám cao thô methanol được khảo sát và kết quả được tóm tắt và trình bày trong bảng 1.. - Bảng 1: Sự ức chế biến đổi heme thành BH của các cao ở các nồng độ khác nhau. - Nghiệm thức Phần trăm heme bị ức chế. - 4 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml 0,5 mg/ml 0,25 mg/ml 0,125 mg/ml Không cao chiết 0 a 0 c 0 d 0 d 0 e 0 b. - Bá bịnh 0 a 1,62 c 0 d 0 d 1,66 e 0,15 b Càng cua 0 a 19,27 b 60,52 b 24,81 b 20,46 d 0,85 b. - Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở nồng độ 4 mg/ml và nồng độ 0,125 mg/ml hầu hết các cao chiết không có hiện tượng ức chế sự biến đổi heme thành BH. - Cây Thần thông, cây Bá bịnh gần như không ức chế sự biến đổi heme thành BH ở các nồng độ khảo sát, riêng cây Lốt có ức chế ở nồng độ 0,25 mg/ml.. - chế), cao chiết từ cây Chó đẻ thân hồng (có 17,36% heme bị ức chế), cao chiết từ cây Chó đẻ thân xanh (có 12,23% heme bị ức chế) và nghiệm thức cao chiết từ cây Càng cua (có 19,27% heme bị ức chế). - Kết quả thí nghiệm của Quan et al. - (2003) khi sử dụng cao chiết methanol từ cây Chó đẻ thân xanh (Phylanthus amarus) ủ ở nồng độ 5,9 μg/ml với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum thì có 50% ký sinh trùng sốt rét bị ức chế không thể phát triển, còn cao chiết H 2 O-methanol từ cây Gòn (Ceiba pentandra) cũng làm ảnh hưởng đến quá trình phát triển của ký sinh trùng sốt rét, ở nồng độ 3 μg/ml ức chế 50% ký sinh trùng sốt rét không phát triển (Khan et al., 2008).. - Mẫu cao chiết từ cây Càng cua có hoạt tính ức chế sự tổng hợp BH xuất hiện liên tục ở các nồng độ khác nhau (2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml và 0,25 mg/ml) được thực hiện thí nghiệm để tìm giá trị IC 50 (nồng độ cao chiết ức chế 50% sự tổng hợp BH từ heme). - Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ức chế biến đổi heme thành BH của cao Càng cua được trình bày trong hình 1 cho thấy, ở nồng độ 0,125 mg/ml thì cao chiết từ cây Càng cua không ức chế sự hình thành BH (100% heme biến đổi thành BH), khi tăng nồng độ lên 0,25 mg/ml thì bắt đầu có hiện tượng ức chế sự hình thành BH (20,56% heme bị ức chế không biến đổi thành BH). - Khi tăng nồng độ cao chiết đến 4 mg/ml thì không xảy hiện tượng ức chế nữa (100% heme biến đổi thành BH). - Trong dãy nồng độ thí nghiệm, khi ở nồng độ cao chiết là 1 mg/ml thì xảy ra hiện tượng ức chế cao nhất (có 62,46% heme bị ức chế).. - Hình 1: Khả năng ức chế sự tổng hợp BH của cao chiết Càng cua. - Giá trị IC 50 của cao chiết Càng cua được tính toán dựa vào đồ thị (Hình 1) cho thấy IC 50 của cao Càng cua là 0,8 mg/ml. - Từ kết quả thí nghiệm cho ta thấy, nồng độ cao chiết của cây Càng cua có hoạt tính tăng dần từ 0,25 mg/ml đến 1 mg/ml, cao nhất là 1 mg/ml, khả năng ức chế của cây Càng cua giảm khi nồng độ lớn hơn 1 mg/ml. - Điều này cũng phù hợp với cơ chế tác dụng của các thuốc sốt rét lên sự ức. - heme bị ức chế. - Nồng độ cao methanol Càng cua (mg/ml). - Sự tương tác này sẽ làm cho các dimer (hai phân tử heme liên kết nhau) không liên kết được với nhau để tạo thành BH. - Như vậy, nồng độ cao chiết cây Càng cua 1 mg/ml, có thể có những thành phần hóa học nào đó tương tác với heme tối ưu nhất để ức chế sự tổng hợp BH.. - 3.2 Khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH của các phân đoạn cao Càng cua Cao methanol được tiếp tục trích bằng hai pha lỏng–lỏng của dung môi nước và diethyl ether. - Sau đó các cao này gồm cao methanol, cao nước và cao diethyl ether được khảo khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH theo phương pháp của Huy et al. - Kết quả thí nghiệm được trình bày trong hình 2 cho thấy các cao methanol, cao nước và cao diethyl ether của cây Càng cua đều có khả năng ức chế sự tổng hợp BH. - Cao methanol ức chế mạnh nhất ở nồng độ 1 mg/ml và có thể ức chế 84,7% sự kết tinh của heme thành BH. - Kết quả thí nghiệm này khá phù hợp với thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH của cao methanol được khảo sát trong phần 3.1. - Tuy nhiên, khả năng ức chế của cao methanol từ cây Càng cua trong thí nghiệm này cao hơn so với phương pháp tinh sạch BH sau phản ứng (62,46% heme bị ức chế) bởi vì phương pháp trong thí nghiệm này hiệu suất phản ứng cao hơn (dữ liệu không trình bày). - Cao nước cho thấy cũng ức chế sự biến đổi heme thành BH tương tự như đối với cao methanol và ở nồng độ 2 mg/ml cho thấy có khả năng ức chế cao nhất với tỷ lệ 79,79%.. - Riêng sự ức chế biến đổi heme thành BH đối với cao diethyl ether thấp hơn so với cao methanol và cao nước, ở nồng độ 2 mg/ml chỉ ức chế 41,46%. - Như vậy, những chất có hoạt tính ức chế sự biến đổi heme thành BH có thể là những chất tan trong nước. - Hình 2: Sự ức chế sự tổng hợp BH của cao chiết Càng cua. - cao methanol cao nước cao diethylether. - Nồng độ cao (mg/ml). - hemebị ức chế. - 3.3 Khảo sát khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH của các phân đoạn (fraction, F) sau khi phân tích HPLC của cao nước từ cây Càng cua. - Các phân đoạn của cao nước sau khi tách bằng HPLC được thử khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH in vitro. - Chúng tôi tách được nhiều phân đoạn của cao nước, sau khi xác định khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH chúng tôi tìm được sáu phân đoạn có khả năng ức chế sự tổng hợp BH in vitro, sáu phân đoạn này được ký hiệu từ F1 đến F6. - Kết quả thí nghiệm được trình bày trong hình 3 cho thấy ở nồng độ 5 µg/ml tất cả các phân đoạn từ F1 đến F6 đều có khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH khá mạnh. - Tỷ lệ phần trăm heme bị ức chế của phân đoạn F1, F2, F3, F4, F5, F6 ở 5 µg/ml lần lượt là . - Nồng độ các phân đoạn (g/ml). - Hình 3: Sự ức chế sự tổng hợp BH của các phân đoạn HPLC. - 3.4 Sự ức chế tổng hợp BH ở pRBC của các phân đoạn HPLC. - Chúng tôi khảo sát khả năng ức chế sự tổng hợp BH của các phân đoạn cao methanol, cao nước, cao diethyl ether và các phân đoạn của cao nước sau khi phân tách bằng HPLC cho thấy ở mức độ tế bào các cao này đều ức chế sự tổng hợp BH (Hình 4) sự ức chế của các cao này so với mẫu đối chứng đều khác biệt có ý nghĩa thống kê.. - Hình 4: Khả năng ức chế sự tổng hợp BH ở mức độ tế bào của các cao Càng cua. - Tương tự khả năng ức chế sự tổng hợp BH của các phân đoạn HPLC của cao nước sau khi phân tách bằng kỹ thuật HPLC ở mức độ tế bào được trình bày trong hình 5. - Kết quả ở hình 5 cho thấy các phân đoạn của cao nước sau khi tách bằng HPLC có khả năng ức chế ở mức độ in vitro đều có khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH ở mức độ tế bào một cách khác biệt rất có ý nghĩa thống kê.. - Hình 5: Khả năng ức chế sự tổng hợp BH ở mức độ tế bào của các phân đoạn HPLC. - ĐC dương: 1,5% pRBC + quinine ủ 3 ngày F1-F6: 1,5 % pRBC + các phân đoạn HPLC sau 3 ngày ủ. - Tám cây thuốc mà dân gian vẫn sử dụng để trị sốt rét, hoặc hạ sốt đã được khảo sát chứng minh được dây Cóc và cây Càng cua có khả năng ức chế sự tổng hợp BH khá mạnh và ổn định. - Cao chiết Càng cua khi phân tích ở các phân đoạn nước và diethyl ether cũng như HPLC đều ức chế sự biến đổi heme thành BH ở mức độ in vitro và tế bào. - Tất cả các kết quả trên có thể kết luận rằng trong cây Càng cua có những thành phần hóa học có khả năng ức chế sự biến đổi heme thành BH ở mức độ in vitro và mức độ tế bào. - Kết quả mà chúng tôi đạt được góp phần đánh giá nguồn tài nguyên thực vật cây Càng cua theo hướng dược phẩm. - Hiện nay một số ít công trình nghiên cứu cho thấy cây Càng cua có khả năng kháng khuẩn (Khan et al., 2002), cây Càng cua còn được biết có khả năng kháng viêm và chống dị ứng (Maria de et al., 2003. - Xu et al., 2006), ngoài ra cũng có nghiên cứu chứng minh khả năng ức chế tế bào ung thư của một số chất được trích từ cây Càng cua (Xu et al., 2006), cây Càng cua cũng được biết có khả năng hạ sốt, giảm đau (Khan et al., 2008). - Như vậy khả năng kháng sốt rét của các hợp chất trong cây Càng cua được chứng minh trong những thí nghiệm của chúng tôi góp phần bổ sung một cách khoa học và hệ thống những hoạt tính sinh học của các hợp chất có trong cây Càng cua.