- KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA HỆ VI KHUẨN ACID LACTIC PHÂN LẬP TỪ SỮA DÊ VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC. - Enterococcus, kháng kháng sinh, pH thấp, probiotic, sữa dê, vi khuẩn acid lactic Keywords:. - Mười sáu dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MRS, trong đó 13 dòng phân lập từ sữa dê và 3 dòng từ chế sinh học. - Phần lớn các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, màu sắc trắng đục đến trắng sữa, độ nổi dạng mô hay lài, bìa nguyên hay chia thùy. - Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập đều Gram dương, không di động và thử nghiệm oxidase âm tính. - Kết quả tuyển chọn được 7 dòng thuộc nhóm vi khuẩn lactic (tỷ lệ 43,8. - Kết quả khảo sát trong môi trường pH thấp cho thấy 6 dòng có khả năng chống chịu môi trường pH 3 trong 3 giờ. - do vi khuẩn gây bệnh đường ruột gây ra. - Sự gia tăng hoạt động kháng vi sinh vật gây bệnh của vi khuẩn probiotic đã mở ra hướng ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh, cũng như là một lựa chọn mới để thay thế thuốc kháng sinh (Ahmed, 2003). - được xem là một trong những nguồn vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic nhưng chưa được nghiên cứu sâu.. - Vi khuẩn probiotic có vai trò và tiềm năng vô cùng to lớn. - Bên cạnh việc ứng dụng các tiềm năng probiotic của vi khuẩn lactic hiện nay chưa thật sự phổ biến và mang lại hiệu quả cao, đặc biệt là trên người. - Khả năng chống chịu môi trường pH thấp và kháng với các loại kháng sinh là các đặc tính rất quan trọng để vi khuẩn probiotic có thể tồn tại mà không bị tiêu diệt nhằm phục hồi hệ vi sinh vật có lợi ở đường ruột (Tambekar và Bhutada, 2010). - Trước thực trạng trên, nghiên cứu này được thực hiện nhằm tuyển chọn ra các dòng vi khuẩn probiotic từ sữa dê có khả năng chống chịu được môi trường pH thấp và kháng các loại kháng sinh phổ biến hiện nay ở nồng độ cao. - môi trường MRS (De Man, Rogosa and Sharpe), dung dịch đệm PBS (Phosphate buffer saline), môi trường nước muối peptone SPW (Saline peptone water). - 3.2 Phân lập vi khuẩn lactic từ sữa dê và chế phẩm men tiêu hóa. - Sau khi hoạt hóa, dung dịch mẫu chứa vi khuẩn được pha loãng và trải trên môi trường MRS agar để tạo các khuẩn lạc rời rạc. - Tiến hành phân lập các dòng vi khuẩn trên môi trường MRS agar đến khi đạt độ ròng nhất định khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.. - Hình dạng, kích thước tế bào và khả năng di động của vi khuẩn được quan sát và ghi nhận dưới kính hiển vi quang học. - Từ kết quả khảo sát các đặc tính sinh học và thử nghiệm sinh hóa sơ bộ chọn ra các dòng vi khuẩn lactic để thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng chống chịu môi trường pH thấp và kháng thuốc kháng sinh.. - 3.4 So sánh và đánh giá khả năng chống chịu môi trường pH thấp. - 3.4.1 Môi trường pH 3. - Các dòng vi khuẩn lactic được chủng vào 2 ml môi trường MRS lỏng, vô trùng để nuôi tăng sinh trong điều kiện kỵ khí ở 37 o C trong 24 giờ. - Sau đó, thu lấy sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 5.000 vòng/phút ở 4 o C trong 10 phút. - Chuyển dịch huyền phù vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường PBS pH 3. - Sau đó, tiến hành đếm mật số vi khuẩn ở mỗi thời điểm khảo sát bằng phương pháp pha loãng mẫu và phương pháp đếm sống (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009). - Các dòng vi khuẩn lactic cũng được khảo sát đồng thời trong môi trường pH 6,4 để đánh giá sự phát triển trong môi trường pH thích hợp.. - 3.4.2 Môi trường pH 2. - Các dòng vi khuẩn lactic có khả năng chống chịu điều kiện pH 3 trong 3 giờ được chọn để tiếp tục khảo sát trong điều kiện môi trường pH 2. - 3.4.3 Môi trường pH 1. - 3.5 Khảo sát khả năng kháng thuốc kháng sinh 3.5.1 Phương pháp tiến hành. - Thí nghiệm được tiến hành khảo sát đối với 5 loại kháng sinh Penicillin V, Streptomycin, Cephalexin, Ampicillin và Tetracycline, dựa trên phương pháp khuếch tán đĩa của NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (1997) có thay đổi và bổ sung phù hợp với điều kiện và yêu cầu của thí nghiệm: Tiến hành trải dung dịch chứa vi khuẩn đã nuôi tăng sinh trong môi trường MRS lỏng trong 24 giờ ở 37 o C trên đĩa petri. - Đồng thời, pha mỗi loại kháng sinh thành dãy gồm 12 nồng độ giảm dần từ mg/l theo phương pháp pha loãng bậc hai từ nồng độ gốc 256 mg/l đã lọc bằng bộ lọc vi khuẩn (Dung et al., 2008). - 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ sữa dê và men tiêu hóa. - Mười sáu dòng vi khuẩn được phân lập từ 10 mẫu sữa dê và 2 loại chế phẩm Bioacimin và Probio. - Phần lớn các dòng vi khuẩn phân lập được có dạng khuẩn lạc hình tròn. - Tất cả các dòng vi khuẩn đều Gram dương và không di động. - Kết quả tuyển chọn được 7 dòng thuộc nhóm vi khuẩn lactic dựa vào hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, đặc điểm Gram và các thử nghiệm sinh hóa (Bảng 1).. - Hình 2: Hình dạng khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê và chế phẩm sinh học: G6.1 (A) và Bio2.1 (B). - Bảng 1: Đặc tính sinh học các dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê và chế phẩm sinh học Dòng. - vi khuẩn Nguồn. - 4.3 Kết quả so sánh và đánh giá khả năng chống chịu môi trường pH thấp. - 4.3.1 Môi trường pH 6,4. - Ở pH 6,4, mật số ban đầu vào thời điểm 0 giờ của các dòng vi khuẩn phân lập có sự khác nhau và dao động trong khoảng từ 7,69-8,91 log(CFU/ml).. - Kết quả khảo sát chứng tỏ pH 6,4 là điều kiện pH thích hợp cho sự tồn tại và ổn định mật số của các dòng vi khuẩn phân lập.. - Bảng 2: Mật số (logCFU/ml) của các dòng vi khuẩn lactic trong môi trường pH 6,4 Dòng. - vi khuẩn. - 4.3.2 Môi trường pH 3. - Kết quả khảo sát ở điều kiện pH 3 cho thấy mật số ban đầu tại thời điểm 0 giờ của các dòng vi khuẩn phân lập có sự khác nhau và dao động trong khoảng từ 7,93-9,10 log(CFU/ml). - Sáu dòng vi khuẩn còn lại (chiếm tỷ lệ 85,7%) đều có mật số giảm sau 3 giờ thí nghiệm và dao động trong khoảng từ 7,82-9,05 log(CFU/ml). - nhiên, xét trong tiêu chí đánh giá khả năng chống chịu môi trường pH thấp, các kết quả khảo sát trên đã chứng minh phần lớn các dòng vi khuẩn lactic phân lập đều có khả năng chống chịu được điều kiện pH 3 trong 3 giờ. - Kết quả khảo sát đã chứng minh hầu hết các dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê và chế phẩm men tiêu hóa đều có khả năng chịu đựng được pH 3 trong 3 giờ. - Bảng 3: Mật số (logCFU/ml) của các dòng vi khuẩn lactic trong môi trường pH 3 Dòng. - 4.3.3 Môi trường pH 2. - Sáu dòng vi khuẩn có khả năng chống chịu môi trường pH 3 trong 3 giờ được tuyển chọn để khảo sát trong điều kiện pH 2. - Khác với kết quả khảo sát trong điều kiện pH 6,4, trong môi trường pH 2 tất cả các dòng vi khuẩn đều có mật số giảm rõ rệt sau 3 giờ thí nghiệm. - Sau 1 giờ khảo sát, tất cả các dòng vi khuẩn đều thể hiện khả năng chống chịu pH 2 với mật số thay đổi không đáng kể so với thời điểm 0 giờ. - Ở thời điểm 2 giờ, vẫn còn 2 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 33,3%) có khả năng chống chịu với điều kiện pH 2. - Các dòng vi khuẩn có khả năng chống chịu bao gồm Bio1.2 và G6.1 với giá trị mật số 9,01 log(CFU/ml). - giờ, tất cả các dòng vi khuẩn không còn khả năng chống chịu với giá trị mật số bằng 0 (Bảng 4). - Sự khác biệt về khả năng chống chịu điều kiện pH 2 của các dòng vi khuẩn có thể giải thích do đây là điều kiện pH rất thấp đối với sự tồn tại của nhiều nhóm vi sinh vật, trong đó có nhóm vi khuẩn lactic.. - Bảng 4: Mật số (logCFU/ml) của các dòng vi khuẩn lactic trong môi trường pH 2 Dòng. - 4.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng thuốc kháng sinh. - 4.4.1 Kháng sinh Penicillin V. - Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibitory Concentration) là nồng độ thấp nhất của một loại kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khoảng 24 giờ nuôi cấy (Dung et al., 2008). - Do đó, trong thí nghiệm này hiệu quả kháng kháng sinh của các dòng vi khuẩn phân lập được đánh giá dựa vào giá trị MIC khảo. - Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn lactic phân lập đều có khả năng kháng Penicillin V nồng độ từ 0,125-8 mg/l. - Ở nồng độ từ 16-128 mg/l, có đến 5/6 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 83,3%) biểu hiện kháng với Penicillin V. - Kết quả thí nghiệm đã chứng minh các dòng vi khuẩn phân lập có khả năng kháng Penicillin V ở nồng độ rất cao so với các nhóm vi. - Bảng 5: Khả năng kháng kháng sinh Penicillin V của một số dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê và chế phẩm sinh học. - vi khuẩn Nồng độ kháng sinh (mg/l). - N: Nhạy cảm 4.4.2 Kháng sinh Streptomycin và Cephalexin Streptomycin là kháng sinh thuộc nhóm ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn. - Theo Korhonen (2010), giá trị MIC của Streptomycin đối với phần lớn vi khuẩn lactic nằm trong khoảng 2-256 μg/ml.. - ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn và bền vững với enzyme penicilinase. - Kết quả thí nghiệm này cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn lactic phân lập đều có khả năng kháng Streptomycin và Cephalexin ở nồng độ từ 0,125-256 mg/l (Bảng 6).. - Điều này chứng minh kháng sinh Streptomycin và Cephalexin ở giới hạn nồng độ khảo sát lên đến 256 mg/l vẫn chưa ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập.. - Bảng 6: Khả năng kháng kháng sinh Streptomycin và Cephalexin của một số dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê và chế phẩm sinh học. - Hình 3: Khả năng kháng kháng sinh Penicillin V (P), Streptomycin (S) và Cephalexin (C) ở nồng độ 256 mg/l của dòng vi khuẩn Bio2.1 (A) và G6.1 (B). - 4.4.3 Kháng sinh Ampicillin. - Ampicillin là loại kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm beta-lactam có tác động chủ yếu vào quá trình nhân đôi của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp mucopeptide của màng tế bào vi khuẩn. - Kết quả khảo sát thể hiện, tất cả các dòng vi khuẩn phân lập kháng Ampicillin ở nồng độ từ 0,125-64 mg/l. - Tuy nhiên, ở nồng độ 128 mg/l, vẫn còn 4/6 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 66,6%) biểu hiện kháng (bao gồm các dòng Bio2.1, G1.1, G5.6 và G6.1). - Đến nồng độ 256 mg/l, không có dòng vi khuẩn nào biểu hiện kháng với kháng sinh Ampicillin.. - Bảng 7: Khả năng kháng kháng sinh Ampicillin của một số dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê và chế phẩm sinh học. - STT Dòng vi khuẩn. - Nồng độ kháng sinh (mg/l). - Kết quả khảo sát cho thấy, tất cả các dòng vi khuẩn phân lập có khả năng kháng Tetracycline ở nồng độ từ 0,125-16 mg/l. - Ở nồng độ 32 mg/l, có 5/6 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 83,3%) biểu hiện kháng. - Với nồng độ 64 mg/l, chỉ còn 3/6 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 50,0%) biểu hiện kháng, các dòng còn lại thể hiện mức độ trung gian với Tetracycline ở nồng độ này. - Đến nồng độ 128 mg/l và 256 mg/l, chỉ có dòng vi khuẩn Probi (chiếm tỷ lệ 16,6%) biểu hiện kháng với Tetracycline.. - Tetracycline ức chế sự tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn bằng cách gắn vào phần 30S của ribosome, do đó ức chế gắn aminoacyl-tRNA mới vào vị trí tiếp nhận. - (2008) chỉ có khoảng 30% (trong tổng số 50 dòng vi khuẩn gây. - Khả năng kháng của vi khuẩn probiotic với một số kháng sinh có thể được sử dụng cho cả hai mục đích phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột (EI-Naggar, 2004).. - Bảng 8: Khả năng kháng kháng sinh Tetracycline của một số dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê và chế phẩm sinh học. - Hình 4: Khả năng kháng kháng sinh Ampicillin (A) và Tetracycline (T) ở nồng độ 64 mg/l của dòng vi khuẩn Probi (A) và G6.1 (B). - Mười sáu dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MRS agar từ nguồn sữa dê và chế phẩm sinh học. - Phần lớn các dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục đến trắng sữa, độ nổi dạng mô hoặc lài, bìa nguyên hay chia thùy. - Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập đều Gram dương, không di động và có thử nghiệm oxidase âm tính. - Từ các kết quả khảo sát tuyển chọn được 7 dòng thuộc nhóm vi khuẩn lactic. - Đặc biệt, dòng Bio1.2 và G6.1 có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trường pH 2 trong 2 giờ