- KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VÀ SỰ ĐA DẠNG CỦA VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG AO NUÔI TÔM. - Kết quả nghiên cứu và thông tin về vi khuẩn chuyển hóa đạm trong ao nuôi tôm sú thâm canh hiện nay chưa nhiều. - Việc nghiên cứu động thái của nhóm vi khuẩn này trong ao nuôi tôm sú thâm canh có thể giúp cho quá trình quản lý ao nuôi hiệu quả hơn. - Chính vì thế nghiên cứu về mật độ vi khuẩn, tính đa dạng và loài chiếm ưu thế của nhóm vi khuẩn chuyển hóa đạm trong ao nuôi tôm sú thâm canh đã được thực hiện ở vùng nuôi tôm sú thâm canh ở Sóc Trăng. - Mật số vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khả hữu (Most Probable Number) và sinh học phân tử (Real-time PCR). - Sự đa dạng quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm được xác định bằng kỹ thuật DGGE (Điện di biến tính). - Kết quả phân tích cho thấy mật số vi khuẩn chuyển hóa đạm (MPN) dao động trong khoảng MPN/g bùn, không có sự khác biệt lớn qua các đợt thu mẫu. - Vi khuẩn Nitrosomonas biến động từ MPN/g. - Mật độ vi khuẩn Nitrobacter phân tích bằng kỹ thuật RT-PCR trong khoảng MPN /g bùn. - Quần thể vi khuẩn không có sự biến động nhiều trong suốt vụ nuôi đã được kiểm chứng bằng kỹ thuật DGGE. - Vi khuẩn chiếm ưu thế trong suốt vụ nuôi là Nitrosomonas europaea.. - Để giải quyết vấn đề này một trong những biện pháp hiệu quả và đang được khuyến kích là sử dụng chế phẩm sinh học có chứa các chủng vi khuẩn thúc đẩy quá trình nitrate hóa như Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter (Gromen et al., 2001. - Ngoài ra, các nghiên cứu đánh giá xem các chủng vi sinh vật khi đưa vào môi trường nuôi có tồn tại và phát triển hay không và nghiên cứu khảo sát sự biến động thành phần của vi khuẩn nitrate hóa trong ao nuôi tôm sú thâm canh chưa được ghi nhận.. - Vi khuẩn oxy hóa ammonium Nitrosomonas thành nitrate (ammonium oxidation bacteria – AOB) được biết là nhóm vi khuẩn khó phân lập và nuôi do chúng không có khả năng sống trên môi trường thạch và không thể hình thành khuẩn lạc trong điều kiện thời gian cho phép (Trần Cẩm Vân, 2005. - Vì vậy, để xác định mật độ vi khuẩn không thể áp dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa. - Một phương pháp được sử dụng phổ biến để đếm số lượng của vi khuẩn AOB là kỹ thuật MPN (Most Probable Number) (Morrill và Dawson, 1967. - Vì vậy để xác định chính xác mật độ vi khuẩn tham gia chuyển hóa đạm cần áp dụng phương pháp chính xác hơn như PCR định lượng, hoặc DGGE.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp thu mẫu. - Mẫu nước và bùn đáy ao được thu vào đầu vụ, giữa vụ, cuối vụ tại 2 ao nuôi tôm sú thâm canh ở Sóc Trăng. - 2.2.1 Phương pháp xác định chất lượng nước trong môi trường ao nuôi. - Tất cả các chỉ tiêu môi trường được phân tích theo phương pháp chuẩn (APHA et al., 1995).. - 2.2.2 Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa bằng phương pháp MPN (Ehrlich, 1975). - Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp số khả hữu (MPN) (Ehrlich, 1975) Chuẩn bị môi trường tiệt trùng ammonium-calcium-carbonate (1 L) cho MPN của nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonium (Nitrosomonas): (NH 4 ) 2 SO 4 (0,5g). - Đếm mật số Nitrosomonas và Nitrobacter bằng phương pháp MPN: Đếm vi khuẩn trong 1gam mẫu bùn trong các ống nghiệm chứa môi trường trên. - Kiểm tra sự có mặt của NO 2 - ở các ống nghiệm chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn và các ống đối chứng âm bằng thuốc thử Griess-Ilosway.. - 2.2.3 Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa bằng kỹ thuật Real-time PCR (RT- PCR). - Ly trích ADN và tinh sạch ADN dựa theo mô tả của Boon et al., (2002) Xác định mật số vi khuẩn Nitrosomonas bằng kỹ thuật Real-time PCR. - Qui trình PCR : Dòng vi khuẩn chọn làm đối chứng dương là Nitrosomonas europaea NCIMB 11849 được cung cấp bởi Đại học Leuven, Bỉ. - Trong qui trình PCR, cặp mồi chuyên biệt cho vi khuẩn Nitrosomonas europaea có trình tự như sau: New1265F:. - Xác định mật số vi khuẩn Nitrobacter bằng kỹ thuật Real-time PCR:. - Qui trình PCR : Dòng vi khuẩn chọn làm đối chứng dương là Nitrobacter winogradskyi (ATCC 25381) phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh được định danh bằng kỹ thuật giải trình tự tại Viện CNSH, Đại học Cần Thơ (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010). - PCR sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho vi khuẩn Nitrobacter nhắm vào 16S rRNA Nwi70F 5’-GGCGTAGCAATACGTCAG -3’. - 2.2.4 Xác định sự đa dạng quần thể vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE. - Sự đa dạng của quần thể vi khuẩn trong bùn đáy ao nuôi tôm được đánh giá dựa trên kết quả chạy điện di biến tính cho sản phẩm PCR của khuông mẫu DNA trích từ bùn đáy ao vào các thời điểm nuôi khác nhau với cặp mồi đa tương thích (general primers for bacteria) nhằm vào 16S rRNA F984-GC/R1378 (Gelsomino, et al., 2006).. - Sự hiện diện của các vạch xác định sự đa dạng của quần thể vi sinh vật.. - Nhiệt độ trong thời gian thu mẫu dao động từ 26-30 o C (Bảng 1), thích hợp cho sự phát triển của tôm và nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Boyd, 1998. - Theo Whatstone et al (2002) nồng độ NO 2 - trong ao nuôi tôm phải nhỏ hơn 0,23 ppm được xem là an toàn cho tôm. - Hàm lượng NO 3 - tăng cao có thể là do mật độ vi khuẩn Nitrobacter đã tăng cao trong ao nuôi tham gia chuyển hóa NO 2 - sang NO 3. - pH tương đối ổn định và mật độ vi khuẩn trong bùn tăng dần theo thời gian nuôi làm cho quá trình phân hủy diễn ra nhanh chóng nên chất hữu cơ không tích lũy nhiều mà có xu hướng giảm. - 3.2 Biến động mật số vi khuẩn nitrate hóa bằng phương pháp MPN. - Kết quả xác định mật độ vi khuẩn nitrate hóa được thể hiện qua Bảng 2. - Qua Bảng 2 và 3 cho thấy nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonium (AOB) dao động khoảng MPN/g. - Kết quả nghiên cứu này tương tự với một số nghiên cứu trước đó về xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa bằng phương pháp MPN như Kemedtsson et al., (1998) ghi nhận mật vi khuẩn dao động MPN/g ở độ pH đất từ 5-6. - Ngoài ra trong một nghiên cứu khác của Phạm Thị Tuyết Ngân và Nguyễn Hữu Hiệp (2010), biến động mật độ vi khuẩn nitrate hóa bằng phương pháp MPN trong ao nuôi tôm sú thâm canh dao động từ 7 đến 2,6×10 3 MPN/g. - Cũng trong nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân và Nguyễn Hữu Hiệp (2010), khảo sát biến động mật độ vi khuẩn nitrite hóa bằng phương pháp MPN trong ao nuôi tôm sú thâm canh dao động từ 5,5 đến 2,6 ×10 3 MPN/g. - Từ các kết quả trên cho thấy khi phân tích bằng phương pháp MPN mật số vi khuẩn thường dao động nhỏ hơn 10 4 MPN/g. - Phương pháp dựa trên độ pha loãng. - (1999) mật số vi khuẩn khi xác định bằng phương pháp MPN bị ảnh hưởng bởi nồng độ amoni sunfat trong môi trường nuôi vi khuẩn dễ gây nhầm lẫn, độ chính xác không cao, không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.. - 3.3 Biến động mật số vi khuẩn N. - Bảng 2: Biến động mật số N. - europaea bằng phương pháp MPN và Real-time PCR Thời vụ Phương pháp MPN (MPN/g) Phương pháp RT-PCR (MPN /g). - Kết quả xác định mật độ N. - europaea bằng phương pháp Real-time PCR được thể hiện trong Bảng 3. - Qua Bảng này cho thấy mật độ vi khuẩn N. - Có sự biến động trong mùa vụ, đầu vụ mật độ vi khuẩn 10 2 tế bào/g bùn, cao nhất giữa vụ 10 4 MPN/g.. - Vào cuối vụ nuôi mật độ vi khuẩn giảm nhưng không đáng kể 0,7×10 3 MPN/g bùn.. - Mật độ vi khuẩn AOB tương đối ít biến động hơn so với nhóm NOB có thể do AOB dễ thích nghi với sự thay đổi môi trường. - Dựa trên kết quả phân tích bằng phương pháp MPN, mật số vi khuẩn Nitrosomonas dao động trong khoảng 1,1×10 2 đến 4,6×10 4 MPN/g. - Nếu so sánh 2 phương pháp nhận thấy mật số gần tương đương nhau, trong trường hợp này có thể kết luận loài ưu thế trong nhóm vi khuẩn tham gia giai đoạn đầu của quá trình nitrate hóa là N. - europaea, mặc dầu theo lý thuyết có 4 nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hoá: Nitrosomonas, Nitrozocystis, Nitrozolobus và Nitrosospira. - Hầu hết các nghiên cứu bằng phương pháp sinh học phân tử cho kết quả cao hơn, nhanh hơn so với phương pháp truyền thống MPN. - Qua đó cho thấy sử dụng RT-PCR xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa chính xác và nhanh chóng hơn.. - 3.4 Sự biến động mật số vi khuẩn Nitrobacter bằng kỹ thuật Real time-PCR Mật độ trung bình nhóm NOB trong bùn đáy ao dao động từ MPN/g bùn (Bảng. - Trong khi đó phân tích với kỹ thuật RT-PCR mật số dòng vi khuẩn N.. - Qua kết quả phân tích này cho thấy, áp dụng phương pháp MPN có nhiều nhược điểm, có thể lúc pha loãng mẫu chưa thích hợp. - Trong 4 giống thuộc nhóm vi khuẩn NOB chỉ có Nitrobacter được chứng minh có nhiều trong đất và bùn (Schmidt và Blser, 1994. - Kuenen và Robertson, 1988), nhóm vi khuẩn này giữ vai trò quan trọng nhất trong bước thứ hai của quá trình nitrate hoá, nhưng chỉ có 2 loài được xác định là N. - Bảng 3: mật số Nitrobacter bằng phương pháp MPN và RT-PCR. - Thời vụ Phương pháp MPN (MPN/g) Phương pháp RT-PCR (MPN/g) Đầu vụ Giữa vụ . - 3.5 Xác định sự đa dạng quần thể bằng kỹ thuật DGGE 3.5.1 Sản phẩm PCR. - 3.5.2 Sự đa dạng quần thể vi khuẩn trong bùn đáy ao. - Hình 2: Cấu trúc quần thể vi khuẩn trong bùn đáy ao nuôi tôm. - Chú thích: Mỗi vạch trên mỗi giếng tương ứng với một loài vi khuẩn (giếng 1: Vi khuẩn thuần N. - giếng 2: hỗn hợp 4 dòng vi khuẩn Nitrosomomas. - Kết quả về cấu trúc quần thể vi khuẩn nitrate hóa trong ao nuôi tôm sú thâm canh trong các đợt thu mẫu được thể hiện trong Hình 2. - Kết quả phân tích sự đa dạng của quần thể vi khuẩn oxi hóa amonium trong các mẫu bùn thu từ ao nuôi tôm sú. - Trên các giếng của các mẫu bùn xuất hiện khá nhiều vạch cho thấy thành phần vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú thâm canh khá đa dạng nhưng loài chiếm ưu thế trong suốt vụ nuôi là Nitrosomonas europaea.. - Cho thấy thành phần của quần thể vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú không có sự biến động lớn trong suốt vụ nuôi. - Các chủng vi khuẩn tương đồng với N. - europaea đã được định danh như là vi khuẩn giữ vai trò oxy hóa amonium và nitrite. - Đồng thời từ kết quả phân tích MPN cho thấy mật độ tổng vi khuẩn Nitrosomonas 5,6×10 4 MPN/g, trong khi kết quả phân tích mật số N.. - europaea là loài chiếm đa số và có vai trò quan trọng trong số vi khuẩn thuộc nhóm AOB có khả năng oxi hóa amonium.. - Tương tự với nghiên cứu của Gorra et al., (2007) khi nghiên cứu mối quan hệ giữa môi trường và sự đa dạng của các quần thể vi khuẩn oxy hóa ammonia trong một vùng đất ngập nước được xây dựng để xử lý nước thải. - Sự đa dạng của quần thể vi khuẩn được xác định bằng phương pháp PCR- DGGE dựa trên các gen 16S rARN. - Kết quả cho thấy trung bình qua các mùa, không có sự khác biệt lớn về thành phần của quần thể vi khuẩn oxy hóa ammonia của phân lớp β - Proteobacteria. - Theo Wang et al (2009) khi phân tích ảnh hưởng của nitrogen lên sự đa dạng thành phần vi khuẩn oxi hóa amonia trong đất bằng kỹ thuật DGGE cho thấy rằng có sự tồn tại của các nhóm Nitrosomonas maria, N. - thúc đẩy sự phát triển nhóm vi khuẩn Nitrosomonas spp nhưng không thấy sự phát triển nhóm Nitrosospira. - Đã thành công khi phát triển xác định mật số, tính đa dạng và loài chiếm ưu thế của nhóm vi khuẩn Nitrate trong môi trường ao nuôi tôm sú thâm canh bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Đã xác định được mật số vi khuẩn Nitrosomonas europaea dao động. - Đa dạng của quần thể các vi khuẩn đã được xác định bằng kỹ thuật DGGE. - Thành phần vi khuẩn rất đa dạng với hơn 10 loài. - Vi khuẩn chiếm ưu thế có chức năng oxi hóa amonium được phát hiện trong bùn có sự tương đồng cao với N. - Phương pháp RT-PCR định lượng cho kết quả nhanh chóng, chính xác. - Tiếp tục nghiên cứu để tối ưu và đơn giản hóa phương pháp. - DGGE được xem là một trong những phương pháp mới nghiên cứu về sự đa dạng của quần thể vi sinh vật. - Bước đầu đã thành công khi nghiên cứu về sự đa dạng của quần thể vi khuẩn Nitrate hóa trong ao nuôi tôm sú thâm canh. - Nên tiếp tục nghiên cứu trên nhiều hệ sinh thái khác nhau để đa dạng hóa, tối ưu hóa phương pháp.. - Quản lý sức khoẻ tôm trong ao nuôi. - Biến động mật độ vi khuẩn hữu ích trong ao. - nuôi tôm sú (Penaeus monodon) thâm canh