- KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM Aspergillus fumigatus ET3 ĐỂ TĂNG HIỆU SUẤT SẢN SINH PHYTASE. - Study of some culture conditions of Aspergillus fumigatus ET3 for high level of phytase production. - Aspergillus fumigatus ET3 appeared to have high potential for phytase production. - fumigatus ET3 were investigated. - Trong nghiên cứu trước đó, chủng nấm Aspergillus fumigatus ET3 được xem có tiềm năng trong việc sản sinh enzyme phytase. - Việc thiết lập được môi trường nuôi cấy thích hợp nhất để thu nhận hàm lượng phytase cao để hạ giá thành sản xuất enzyme từ chủng nấm mốc này là rất cần thiết. - Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng nấm mốc Aspergillus fumigatus ET3 với mật số bào tử chủng vào môi trường là 10 8 bào tử/mL, pH dung dịch khoáng bổ sung là 4 có khả năng sinh tổng hợp phytase cao nhất trên nguồn cơ chất là bột mì sau 2 ngày nuôi ở nhiệt độ môi trường là 35 o C.. - Ngoài ra, các dưỡng chất khác khi tạo phức với phytate cũng trở nên dễ tiêu hoá hơn, từ đó làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn và giảm ô nhiễm môi trường.. - fumigatus có nhiều đặc tính nổi trội phù hợp bổ sung vào thức ăn chăn nuôi như tính đặc hiệu với cơ chất rộng, pH tối ưu thấp ở 2,5 và 5,5, có khả năng hồi tính cao sau khi biến tính ở nhiệt độ cao (Pasamontes et al., 1997;. - Thực tế, ở Việt Nam số lượng nghiên cứu về enzyme từ loài nấm mốc này còn hạn chế. - fumigatus ET3 và thiết lập được môi trường nuôi cấy thích hợp nhất để thu nhận hàm lượng phytase cao.. - Chủng nấm A. - fumigatus ET3 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.. - Môi trường bán rắn (Arpana et al., 2012) nuôi cấy A. - Hóa chất dùng để xác định hoạt tính và định lượng protein: sodium phytate (C 6 H 6 Na 12 O 24 P 6 H 2 O) (Sigma), sulfuric acid (H 2 SO 4. - 2.2.1 Chuẩn bị mốc giống và môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp phytase. - fumigatus ET3 được nuôi trên đĩa petri với môi trường (potato-glucose agar) PGA, ủ ở nhiệt độ cao 45 o C trong 2 ngày. - Cho 10 mL nước cất vô trùng vào mỗi đĩa mốc giống sau đó hòa đều dịch bào tử, đếm mật số, chỉnh mật số bào tử phù hợp với từng thí nghiệm. - Chủng 1 mL dung dịch bào tử nấm mốc vào túi nilon nhựa chứa 45 g môi trường bán rắn cơ bản đã khử trùng, bổ sung dung dịch khoáng với tỉ lệ 55,5% (w/w), ủ ở nhiệt độ khảo sát của các thí nghiệm. - Sau đó thu sinh khối tươi sau từng thí nghiệm khảo sát.. - fumigatus ET3. - 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính phytase theo phương pháp của Heinonen và Lahti (1981). - Một đơn vị hoạt tính của phytase (U) được xác định như là 1 µmol P vô cơ được giải phóng từ sodium phytate trong mỗi phút dưới điều kiện chuẩn (pH 5,5. - nhiệt độ 55 o C).. - 2.2.4 Khảo sát điều kiện môi trường nuôi cấy để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp phytase của A.. - Mục đích: Chọn được thời gian nuôi cấy, nguồn phytate, mật số bào tử, pH và nhiệt độ thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy để nấm mốc A. - fumigatus ET3 sinh tổng hợp phytase cao nhất.. - Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và cơ chất phytate. - Thí nghiệm được bố trí theo kiểu thừa số 2 nhân tố là thời gian nuôi được thay đổi với 5 mức độ: ngày và 3 loại cơ chất là bột bắp, bột mì và bột đậu nành. - Tổng cộng có 45 đơn vị thí nghiệm.. - Nấm mốc được nuôi trên môi trường bán rắn với 3 loại cơ chất khác nhau, với mật số bào tử 10 9 bào tử/mL, pH môi trường 4, ở 45 o C. - Thu mẫu và xác định hoạt tính của phytase theo các thời gian khác nhau như đã bố trí.. - Khảo sát sự ảnh hưởng của mật số bào tử Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố là mật số bào tử với các mức khác nhau bào tử/mL).. - Nấm mốc được nuôi trên môi trường bán rắn có các mật số bào tử khác nhau như đã bố trí và với thời gian nuôi, nguồn phytate thích hợp từ thí nghiệm trên. - pH ban đầu môi trường nuôi là 4, ở 45 o C.. - Khảo sát sự ảnh hưởng của pH. - Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố là pH với các giá trị khác nhau: pH . - Nấm mốc được nuôi trên môi trường bán rắn có các giá trị pH khác nhau như đã bố trí và nguồn phytate, thời gian nuôi cấy và mật số bào tử phù hợp được chọn từ các thí nghiệm trên, ở 45 o C.. - Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố là nhiệt độ với các giá trị khác nhau: 30 o C, 35 o C, 40 o C, 45 o C, 50 o C, 55 o C và 60 o C.. - Nấm mốc được nuôi trên môi trường bán rắn có các giá trị nhiệt độ khác nhau như đã bố trí và thời gian nuôi, nguồn phytate, mật số bào tử, pH phù hợp được chọn từ các thí nghiệm trước.. - Khảo sát sự ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ và pH. - Thí nghiệm được bố trí theo kiểu thừa số với 2 nhân tố là nhiệt độ và pH của dung dịch khoáng từ các giá trị cao nhất của các thí nghiệm trước.. - Các giá trị cao nhất về nhiệt độ và pH khác nhau như đã bố trí được nuôi trên môi trường bán rắn.. - Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính phytase (U/g cơ chất khô). - Phytase thô được trích ly theo 2.2.2 và xác định hoạt tính theo Heinonen và Lahti (1981).. - 3.1 Ảnh hưởng tương tác của cơ chất và thời gian nuôi cấy lên hiệu quả sinh tổng hợp phytase. - Dựa vào biểu đồ và kết quả xác định hoạt tính enzyme theo sinh khối nấm mốc thu nhận được theo thời gian và các nguồn phytate (Hình 2) cho chấy chủng A. - fumigatus ET3 phát triển trên các cơ chất khác nhau thì có thời gian tối ưu và khả năng sinh hoạt tính cũng khác nhau.. - Hoạt tính (U/g). - Hình 2: Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. - fumigatus ET3 theo thời gian và nguồn phytate bổ sung Trên cơ chất đậu nành, chủng nấm này thể hiện. - hoạt tính tăng dần từ ngày thứ 2, cao nhất vào ngày thứ 3 và giảm dần từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 6.. - Trong khi đó, với cơ chất là bột bắp, hoạt tính tăng mạnh hơn cũng từ ngày thứ hai và đạt cao nhất vào ngày thứ 4. - Đặc biệt với cơ chất bột mì, chủng nấm này sinh hoạt tính cao nhất chỉ sau 2 ngày nuôi, sau đó hoạt tính liên tục giảm ở các ngày khảo sát còn lại. - Sau ngày thứ nhất quá trình sinh tổng hợp enzyme mới bắt đầu diễn ra mạnh mẽ vì thời gian đó nấm mốc đã thích nghi với môi trường và bắt đầu diễn ra các phản ứng sinh hoá sử dụng chất dinh dưỡng của môi trưởng để sinh trưởng và phát triển. - Trên các cơ chất này sau 5 ngày hoạt tính bắt đầu giảm mạnh do quá trình sinh tổng hợp enzyme gần kết thúc vì độ ẩm và các nguồn dinh dưỡng từ môi trường bắt đầu giảm mạnh. - Kết quả thí nghiệm này khác với nghiên cứu của các tác giả như Trần Thị Tuyết (2004) trên nấm mốc A. - niger nuôi cấy ở 30 o C thì thời gian sinh tổng hợp phytase cao nhất là 6 ngày. - Điều này cho thấy chủng nấm mốc vừa phân lập có thời gian tối ưu khá ngắn khi được nuôi ở nhiệt độ cao (45 o C) và đây là một ưu điểm của chủng A. - Bột đậu nành có hoạt tính enzyme thấp nhất vì thành phần trong đậu nành giàu protein, nên ngoài sinh enzyme phytase chủng nấm này còn sinh enzyme protease (Wang et al., 2005). - Protease được biết đến là một enzyme có khả năng thủy phân protein, do đó enzyme này phân cắt phytase làm cho hoạt tính phytase giảm mạnh. - Qua thí nghiệm này, thời gian nuôi cấy 2 ngày và nguồn phytate là bột mì được xem là tối ưu để chủng A. - fumigatus ET3 sinh tổng hợp phytase cao nhất và được chọn để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.. - 3.2 Ảnh hưởng của mật số bào tử lên hiệu quả sinh tổng hợp phytase. - Dựa vào biểu đồ ở Hình 3 cho thấy hoạt tính phytase bắt đầu tăng dần từ mật số 10 6 bào tử/mL với 0,113 (U/g), sau đó tăng lên khoảng 4 lần khi nuôi ở mật số 10 7 bào tử/mL. - Hoạt tính thu được. - Khi mật số bào tử nấm mốc quá cao môi trường nuôi cấy không cung cấp đủ dinh dưỡng để nấm mốc sinh trưởng vì vậy lượng phytase sinh ra môi trường thấp.. - Hình 3: Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của chủng A. - fumigatus ET3 theo mật số bào tử. - fumigatus ET3 sinh nhiều hoạt tính nhất, do đó mật số này được sử dụng cho các thí nghiệm sau.. - 3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả sinh tổng hợp phytase. - Một nghiên cứu của Vohra and Satyanarayana (2003) về môi trường nuôi cấy vi sinh vật sản xuất phytase thì pH, nhiệt độ, oxygen hòa tan và áp suất là những thông số vật lý quan trọng nhất ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng của sinh vật và sinh tổng hợp các chất.. - Hình 4: Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. - fumigatus ET3 theo pH môi trường Qua kết quả thống kê và biểu đồ hoạt tính. - enzyme phytase theo pH môi trường ở Hình 4 cho thấy lượng phytase sinh ra cao nhất khi pH của dung dịch khoáng bổ sung vào là pH 4, ở mức độ thấp hơn là pH 3. - Hoạt tính giảm mạnh ở các giá trị pH khảo sát còn lại (pH 5, pH 6 và pH 7). - Giá trị pH môi trường có ý nghĩa lớn đối với quá trình sinh tổng hợp phytase. - Điều ngạc nhiên là chủng nấm này có khả năng sinh tổng hợp phytase cao ở vùng pH từ 2 đến 5 khác với vùng giá trị pH tối ưu của hầu hết các vi khuẩn và nấm mốc trong khoảng 5 – 7 (Vohra và Satyanarayana, 2003). - Có thể thấy rằng vùng pH tối ưu của chủng nấm mốc vừa phân lập gần giống với kết quả nghiên cứu về pH tối ưu trên A. - fumigatus ET3 sinh phytase, do đó nó được sử dụng ở thí nghiệm tiếp theo. - Ngoài ra, ở khoảng pH từ 2 đến 5, chủng nấm mốc vừa phân lập có khả năng sinh phytase cao nhất nên vùng pH này được chọn để khảo sát sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên khả năng sinh phytase của A. - fumigatus ET3.. - 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên hiệu quả sinh tổng hợp phytase. - Dựa vào kết quả đo hoạt tính (Hình 5) và kết quả thống kê cho thấy chủng nấm mốc này có khả năng sinh hoạt tính cao nhất ở 35 o C. - hoạt tính giảm dần ở 40 o C và 45 o C và bắt đầu giảm mạnh ở 50 o C và 55 o C. - Đặc biệt ở 60 o C hoạt tính phytase nó không còn nữa. - fumigatus được biết đến là loài nấm chịu nhiệt tuy nhiên ở nhiệt độ quá cao quá trình sinh trưởng và phát triển của A.. - fumigatus bị ảnh hưởng vì độ ẩm của môi trường thấp làm ảnh hưởng đến quá trình sinh hóa để sinh phytase.. - Berka et al., 1998) nhiệt độ tối ưu để sản xuất enzyme phytase của hầu hết các vi sinh vật nằm ở cùng nhiệt độ từ 25 o C đến 37 o C, vì ở nhiệt độ này loài nấm này sinh trưởng và phát triển mạnh nhất nên sản sinh lượng phytase nhiều nhất. - Như vậy, kết quả về nhiệt độ tối ưu của A. - Nhiệt độ (oC). - Hình 5: Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. - fumigatus ET3 theo nhiệt độ môi trường. - Vì ở khoảng nhiệt độ từ 30 o C đến 40 o C, chủng nấm mốc A. - fumigatus ET3 có khả năng sinh phytase tối ưu nhất nên vùng nhiệt độ này được chọn để khảo sát sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên khả năng sinh phytase.. - 3.5 Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên hiệu quả sinh tổng hợp phytase. - giá trị pH và 3 giá trị nhiệt độ (30 o C, 35 o C, 40 o C) từ thí nghiệm 4.3.3 và 4.3.4 để chọn ra được điều kiện nuôi cấy tốt nhất sinh phytase. - fumigatus ET3 được nuôi trên môi trường bán rắn cơ bản với mật số bào 10 8 bào tử/mL trên cơ chất bột mì. - fumigatus ET3 sản sinh phytase ở 35 o C và pH 4 là lựa chọn tốt nhất, phù hợp với pH tự nhiên của dung dịch khoáng bổ sung.. - Qua các thí nghiệm khảo sát về các điều kiện nuôi cấy, chủng nấm mốc này sinh phytase cao nhất với mật số bào tử chủng vào môi trường nuôi cấy khoảng 10 8 bào tử/mL sau 2 ngày nuôi cấy, trên cơ chất là bột mì, pH của dung dịch khoáng bổ sung là pH 4 ủ trong 35 o C.