- KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY in vitro TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI NGƯỜI. - DMSO/NH 3 , FBS, nuôi cấy tế bào, PHA, tế bào đơn nhân ngoại biên, tối ưu hóa Keywords:. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy in vitro tế bào đơn nhân được phân lập từ máu ngoại vi người (peripheral blood mononuclear cells - PBMCs). - Các tế bào PBMCs được phân lập trong vòng 4 giờ từ khi thu thập máu toàn phần của 10 người tình nguyện đã được chống đông bằng EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) với ống Leucosep ® 10 mL. - Cho 100 µL hỗn dịch 5x10 5 tế bào/mL vào giếng trên đĩa 96 giếng, nuôi ở 37 o C, độ ẩm CO 2 /24 giờ. - Độ sống tế bào được khảo sát bằng phương pháp trypan blue, khảo sát dung môi hòa tan tinh thể formazan và các điều kiện nuôi cấy tế bào như nồng độ FBS (fetal bovine serum), mật độ tế bào PBMCs trong giếng, thời gian nuôi và nồng độ chất phân bào PHA (phytohaemagglutinin) cần cho sự tăng sinh PBMCs. - Kết quả thu được: với vận tốc ly tâm 1.200 xg/20 phút, hơn 95% tế bào PBMCs được chiết từ 6 ml máu toàn phần được tìm thấy vẫn sống với hemocytometer. - PBMCs tăng trưởng tốt nhất trong môi trường nuôi cấy có FBS 10%, mật độ tế bào/giếng và PHA 1,5%. - Các điều kiện tối ưu này có thể ứng dụng cho các thử nghiệm khảo sát tác động của dược liệu hay chất hóa dược mới trên sự tăng trưởng tế bào PBMCs.. - Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy in vitro tế bào đơn nhân được chiết từ máu ngoại vi người. - Singh, 2016), được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của các dược liệu có nguồn gốc tự nhiên trong sự tăng sinh, hoạt hóa các tế bào miễn dịch (như đậu bắp (Abelmoschus esculentus) làm tăng nồng độ lympho T, IL-12 và INF. - hoặc ức chế, giảm hoạt tính của tế bào miễn dịch (như cỏ xạ hương (thymus vulgaris) ức chế sự tăng sinh in vitro PBMCs (peripheral blood mononuclear cells);. - Một trong những mô hình được sử dụng rộng rãi là mô hình in vitro nuôi cấy tế bào miễn dịch đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi người (PBMCs) để thử hoạt tính làm tăng sinh hoặc ức chế miễn dịch của dược liệu. - Hiện nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá tác động của dược liệu hoặc thuốc trên sự tăng sinh hoặc gây độc tế bào PBMCs của người. - Mặt khác, các điều kiện nuôi cấy tế bào PBMCs người trong các nghiên cứu trên thế giới cũng không thống nhất vì mục đích các nghiên cứu khác nhau. - Hơn nữa, việc xác định khả năng sống của tế bào thường được sử dụng để đánh giá các hợp chất có ảnh hưởng lên sự tăng trưởng tế bào hoặc gây ra độc tính trực tiếp trên tế bào, thậm chí gây chết tế bào hay không. - 2,5-diphenyl tetrazolium bromide) hay được sử dụng vì đơn giản, nhanh chóng, chính xác hơn phương pháp đếm tế bào bằng cách nhuộm trypan blue. - Với mong muốn tìm được điều kiện nuôi cấy tế bào PBMCs có thể được dùng cho các nghiên cứu sâu hơn về miễn dịch, đề tài “Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy in vitro tế bào đơn nhân được chiết từ máu ngoại vi người” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: Tối ưu hóa quy trình chiết các tế bào PBMCs là phân đoạn giàu tế bào lympho nhất từ máu ngoại vi người. - Tối ưu hóa phương pháp đánh giá tỷ lệ sống của tế bào với MTT. - Khảo sát một số điều kiện trong quá trình nuôi cấy tế bào PBMCs.. - Các tế bào PBMCs được phân lập càng sớm càng tốt (nghiên cứu này thực hiện phân lập tế bào trong vòng 4 giờ để tránh tế bào PBMCs bị chết ở môi trường ngoài cơ thể) ở nhiệt độ phòng kể từ lúc lấy mẫu. - M của hãng Gibco được dùng trong môi trường nuôi cấy tế bào PBMCs. - Toàn bộ quy trình thu thập mẫu máu và xử lý mẫu đều được thực hiện ở điều kiện vô khuẩn tại nhiệt độ phòng trong phòng nuôi cấy tế bào của Viện Sinh học Nhiệt đới, thành phố Hồ Chí Minh.. - 2.3.1 Tối ưu hóa quy trình phân lập tế bào PBMCs từ máu ngoại vi người. - Sau khi rửa các tế bào PBMCs 2 lần, mỗi lần với 10 mL PBS, tế bào PBMCs được phân tán trong các môi trường khảo sát là PBS hoặc môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (MTNCHC) gồm RPMI FBS + 1% (penicillin 100 IU/mL và streptomycin 100 µg/mL). - Đánh giá tỷ lệ sống của tế bào trong dịch vừa chiết bằng phương pháp nhuộm trypan blue và soi trên buồng đếm hemocytometer Hirschmann (EM Techcolor).. - Cho 100 µL hỗn dịch 5 x 10 5 tế bào/mL vào giếng trên đĩa 96 giếng. - MTT sẽ được tế bào sống khử thành formazan. - Khảo sát mật độ tế bào PBMCs nuôi trong các giếng. - Phương pháp định lượng MTT xác định khả năng sống và tăng sinh của tế bào động vật có vú đã được đề xuất bởi Mosmann (Mosmann, 1983).. - Phương pháp này dựa vào việc tế bào sống có khả năng chuyển muối tetrazolium MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid) bởi enzym dehydrogenase ở ty thể thành sản phẩm formazan có màu xanh tím. - Lượng formazan sinh ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống trong môi trường. - Tuy nhiên, phương pháp MTT phụ thuộc nhiều yếu tố như dòng tế bào nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, số lượng (mật độ) tế bào trong môi trường nuôi cấy, dung môi hòa tan tinh thể formazan… Vì vậy, việc xác định khoảng mật độ tế. - bào nuôi cấy là cần thiết để tối ưu hóa phương pháp MTT.. - Pha giai mẫu hỗn dịch tế bào chứa khoảng 10 4 , 5x10 4 , 7,5x x10 5 , 5x10 5 , và 10 6 tế bào/mL bằng hỗn hợp môi trường RPMI FBS + 1% kháng sinh. - Cho 100 L hỗn dịch tế bào vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng, mỗi nồng độ làm 3 mẫu thử. - Chuẩn bị mẫu trắng như mẫu thử nhưng không có tế bào PBMCs. - 2.3.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tế bào PBMCs. - Khảo sát nồng độ FBS và thời gian nuôi cấy tế bào PBMCs. - Thông thường các nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào in vitro chỉ thực hiện trong vòng 72 giờ. - Vì vậy, để theo dõi độ sống tế bào dưới ảnh hưởng của nồng độ huyết thanh FBS theo thời gian, chúng tôi đánh giá độ sống của các tế bào PBMCs trong các giếng có mật độ ban đầu là 5x10 5 tế bào/mL trong các môi trường nuôi cấy chứa nồng độ FBS thay đổi là với các khoảng thời gian nuôi cấy tế bào khác nhau là giờ. - Mỗi mức nồng độ FBS và thời gian nuôi tế bào được thực hiện lặp lại 3 lần. - Các tế bào được nuôi trong tủ ấm ở 37 o C, độ ẩm 95 ± 5% với 5% CO 2 . - Tỷ lệ sống của tế bào sau một khoảng thời gian nuôi sẽ được đánh giá bằng phương pháp MTT.. - Khảo sát môi trường nuôi cấy tế bào PBMCs. - Sự tăng sinh các tế bào PBMCs trong 3 môi trường nuôi cấy khác nhau là RPMI-1640, DMEM và DMEM F12 được khảo sát với các khoảng thời gian nuôi cấy là giờ. - Tỷ lệ sống của tế bào sau một khoảng thời gian nuôi cấy sẽ được đánh giá bằng phương pháp MTT. - Mẫu thử là các giếng trên đĩa 96 giếng có chứa 100 µL hỗn dịch tế bào PBMCs với mật độ 5 x 10 5 tế bào/mL. - Quy trình nuôi tế bào PBMCs với các điều kiện tương tự như trên. - Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh được xem là tốt nhất khi độ hấp thu của sản phẩm formazan cao nhất.. - Khảo sát nồng độ PHA trong môi trường nuôi cấy PBMCs. - Việc tối ưu hóa nồng độ PHA được thực hiện trên cả 2 môi trường nuôi cấy là RPMI-1640 và DMEM. - Quy trình nuôi tế bào PBMCs với các điều kiện tương tự như trên.. - Nồng độ PHA trong các môi trường nuôi cấy hoàn. - chỉnh được xem là tối ưu khi tỷ lệ tăng sinh tế bào được tính theo độ hấp thu của sản phẩm formazan là cao nhất.. - 3 KẾT QUẢ. - Kết quả tối ưu hóa quy trình phân lập PBMCs từ máu ngoại vi người: Sau khi ly tâm mẫu máu với tốc độ ly tâm 1.200 xg trong 20 phút và cắn tế bào PBMCs được phân tán trong dung dịch PBS cho tỷ lệ tế bào sống là 94,32%, thấp hơn so với khi được phân tán trong MTNCHC (97,11%) (Bảng 1). - Bảng 1: Kết quả đánh giá khả năng sống của tế bào trong các môi trường phân tán cắn tế bào khác nhau bằng phương pháp trypan blue. - PBS MTNCHC Số lượng tế bào sống. - Số lượng tế bào chết. - Tổng số tế bào 132 129,75. - Tế bào sống . - 3.2 Kết quả tối ưu mật độ tế bào, nồng độ FBS và thời gian nuôi cấy tế bào. - Khoảng mật độ tế bào tối ưu để nuôi cấy dành cho các thử nghiệm được xác định từ 10 4 đến 10 5 tế bào/giếng (Hình 2A). - Mặt khác, sau khi nuôi tế bào được 48 giờ, mật độ tế bào trong các giếng giảm so. - Như vậy, MTNCHC cho tế bào PBMCs có nồng độ FBS 10%. - và thời gian nuôi cấy từ 24-48 giờ được xác định là tối ưu cho các thử nghiệm sau này.. - (B) sự thay đổi số lượng tế bào PBMCs theo nồng độ FBS và thời gian nuôi cấy tế bào. - 3.3 Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy tế bào PBMCs. - Tại mỗi thời điểm khảo sát, độ hấp thu của formazan trong các môi trường nuôi cấy giảm theo thứ tự DMEM >. - Đồng thời, ở giữa 3 thời điểm, độ hấp thu của formazan hình thành từ tế bào giảm dần theo thời gian giờ (Hình 3 và Bảng 3). - Như vậy, môi trường DMEM được xem là thích hợp hơn cho việc nuôi cấy PBMCs.. - Hình 3: Minh họa lượng tinh thể formazan trong các giếng chứa 5 x 10 5 tế bào/mL tại các thời điểm nuôi cấy (1) T0, (2) T24 giờ, (3) T48. - giờ và (4) T72 giờ Bảng 3: Kết quả đo độ hấp thu formazan trong các môi trường khác nhau tại giờ. - quy trình nuôi cấy PBMCs. - Ở mức nồng độ PHA 1,5% (tt/tt), tỷ lệ tăng sinh tế bào PBMCs đạt mức độ cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với những nồng độ còn lại sau 48 giờ nuôi. - Ở nồng độ PHA 1%, tế bào tăng nhiều hơn so với giếng có nồng độ PHA 2%. - Kết quả này phù hợp với cả 2 môi trường khảo sát là RPMI-1640 và DMEM (Bảng 4). - Từ các kết quả thực nghiệm trên, nồng độ PHA 1,5% (tt/tt) đã được xác định là tối ưu cho các thử nghiệm trên tế bào PBMCs.. - Bảng 4: Kết quả tỷ lệ tăng sinh tế bào PBMCs được nuôi ở các môi trường có nồng độ PHA khác nhau Môi. - trường Thử nghiệm Tỷ lệ tăng sinh tế bào PBMCs ở các nồng độ PHA khác nhau. - 4.2 Về kết quả khảo sát mật độ tế bào, nồng độ FBS và thời gian nuôi cấy tế bào. - Về kết quả khảo sát mật độ tế bào, loại tế bào khác nhau sẽ sản sinh ra lượng formazan khác nhau.. - Do đó, có những loại tế bào dòng như tế bào dòng ung thư hạch ở chuột, đồ thị biểu diễn mật độ tế bào/giếng theo độ hấp thu formazan tuyến tính từ 200 đến 50.000 tế bào trên giếng (Mosmann, 1983).. - Trong khi đó, kết quả nghiên cứu này cho thấy mật độ của tế bào PBMCs nên chọn ở mức 10 4 đến 10 5 tế bào/giếng cho các thử nghiệm trên PBMCs.. - cần thiết cho sự sống tế bào. - Thời gian nuôi cấy tế bào là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ sống tế bào vì phụ thuộc vào dòng tế bào và môi trường dinh dưỡng (Arora, 2013). - Về kết quả khảo sát nồng độ FBS cho môi trường nuôi cấy, khi thời gian nuôi cấy càng dài thì lượng tế bào trong các giếng khảo sát giảm càng nhiều có thể do tế bào PBMCs là loại tế bào sơ cấp, không thể tự tăng sinh được nếu không có chất kích thích phân bào (như PHA) (Panda and Ravindran, 2013). - Mặt khác, môi trường nuôi cấy không đủ chất dinh dưỡng cung cấp cho quá trình sống và phát triển của tế bào trong thời gian dài.. - 4.3 Về kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy tế bào. - Việc chọn lựa một môi trường nuôi cấy đặc biệt quan trọng vì có thể tác động một cách có ý nghĩa. - đến sự thành công của các thực nghiệm nuôi cấy tế bào. - Thông thường, môi trường nuôi cấy được lựa chọn phụ thuộc vào dạng tế bào nuôi cấy, mục đích nuôi cấy và nguồn nguyên vật liệu có sẵn để nghiên cứu. - RPMI-1640 là một môi trường đa năng cho các tế bào động vật có vú và hay được sử dụng hỗ trợ sự tăng trưởng của nhiều tế bào huyền phù như tế bào lympho người… Trong kết quả nghiên cứu này, dường như môi trường DMEM thích hợp hơn cho việc nuôi cấy PBMCs, thể hiện qua độ hấp thu cao hơn so với kết quả từ 2 môi trường còn lại. - Tuy nhiên, việc lựa chọn môi trường phù hợp cho dòng tế bào nuôi cấy còn phải phụ thuộc nhiều yếu tố khác như mục đích nghiên cứu và nguyên vật liệu có sẵn trong phòng thí nghiệm (Arora, 2013).. - tỷ lệ tăng sinh tế bào thấp hơn ở nồng độ PHA 1,5% có thể do lượng PHA ít nên tế bào phân chia kém hơn. - Nhưng ở nồng độ PHA 2%, tỷ lệ tăng sinh tế bào lại thấp hơn có thể giải thích do tế bào tăng trưởng quá nhanh nên môi trường không đủ dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào. - Mặt khác, tế bào đã sản sinh ra nhiều độc tố trong môi trường nuôi cấy gây chết tế bào. - Kết quả này phù hợp với cả 2 môi trường khảo sát là RPMI-1640 và DMEM.. - Trong nghiên cứu này, một quy trình nuôi cấy tế bào tối ưu cần cho các thử nghiệm khảo sát tác động của dược liệu hay chất hóa dược mới trên sự tăng trưởng tế bào PBMCs đã được xây dựng với các kết quả tối ưu hóa như sau: với vận tốc ly tâm 1.200 xg trong 20 phút, hơn 95% tế bào PBMCs được chiết từ 6 mL máu toàn phần với ống Leucosep ® 10mL đã được tìm thấy vẫn sống bằng phương pháp nhuộm trypan blue và đếm trên hemocytometer. - các điều kiện tối ưu cho môi trường nuôi cấy PBMCs là nồng độ FBS 10%, mật độ từ tế bào/giếng, nồng độ chất kích thích phân bào PHA là 1,5% (tt/tt) cần cho sự tăng trưởng PBMCs.