- KHẢO SÁT SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC Ở TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP. - XỬ LÝ SỐC NHƯỢC TRƯƠNG. - Nghiên cứu xử l ý tế bào thực vật bằng citrate natri (C 6 H 5 Na 3 O 7 ) 0,4% trong thời gian 30 - 60 phút (tùy loài) trước thời điểm phân bào tối ưu để thực hiện tiêu bản hiển vi đã có hiệu quả gây sốc nhược trương tế bào rễ non, lá non, rễ mầm và lá mầm của một số thực vật như chuối nhà (Musa paradisiaca L. - Ở tế bào sinh dưỡng của động vật như não, tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm (Drosophila sp.) được xử lý bằng NaCl 0,5% và tế bào sinh dục của châu chấu đực (Acrida Linnaeus, 1758) được xử lý bằng NaCl 0,4% trước khi cố định và nhuộm bằng phẩm nhuộm aceto-carmine 1% trong thời gian 10 phút cũng gây được sốc nhược trương tế bào. - Số lượng nhiễm sắc thể của loài nghiên cứu đã được khảo sát. - Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khi gây sốc nhược trương trong dung dịch có nồng độ thấp và thời gian kéo dài làm nhiễm sắc thể biến dạng, tế bào vỡ và lạc nhiễm sắc thể.. - Tế bào mỗi loài sinh vật đều bộ nhiễm sắc thể ổn định và đặc trưng. - ổn định chỉ mang tính tương đối do có các nhiễm sắc thể bổ sung (B-chromosome), dị bội, hoặc đa bội. - Việc xác định mức độ sai khác về số lượng nhiễm sắc thể hoặc mức độ đa bội thể của tế bào so với kiểu nhân (karyotype) của loài có thể xác định bằng phương pháp đếm số lượng nhiễm sắc thể, phương pháp đo chỉ số lá, kích thước khí khổng và kích thước hạt phấn. - Tuy nhiên, phương pháp này chỉ hiệu quả khi đã biết 1 giống đối chứng với mức bội thể đã được xác định thông qua đếm số lượng nhiễm sắc thể.. - Kỹ thuật xác định kiểu nhân của các loài liên quan các bước: sử dụng tế bào đang phân chia (hay tế bào nuôi cấy), xử l ý sốc nhược trương, làm dừng quá trình nguyên phân ở kỳ giữa, thực hiện tiêu bản hiển vi, chụp hình nhiễm sắc thể và lập kiểu nhân. - Ở thực vật, việc khảo sát bộ nhiễm sắc thể để xác định kiểu nhân thường thực hiện ở kỳ giữa của phân bào nguyên nhiễm ở mầm non của lá, đỉnh sinh trưởng của thân, đỉnh rễ non của cây hoặc đỉnh rễ chính của hạt vừa nẩy mầm.. - Bên cạnh đó, người ta còn tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của quá trình phân bào giảm nhiễm (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2008). - Tuy nhiên, việc đếm nhiễm sắc thể thường gặp trở ngại lớn ở loài có số lượng nhiễm sắc thể lớn hoặc nhiễm sắc thể có kích thước lớn nên xử l ý nhược trương làm nhiễm sắc thể phân tán trong tế bào, xử lý để nhiễm sắc thể rút ngắn chiều dài hoặc xử lý để tế bào ngừng phân chia ở kỳ giữa là cần thiết. - Mục tiêu của nghiên cứu là xác định phương pháp xử lý sốc nhược trương ở tế bào thực vật và tế bào động vật và ứng dụng việc xử lý sốc nhược trương để đếm số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào thực vật và tế bào động vật.. - Thí nghiệm 1: Xử lý sốc nhược trương và thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để khảo sát số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào thực vật. - Sau khi cố định, thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để xác định thời điểm mà các tế bào của mô phân sinh đang phân bào mạnh và trên tiêu bản quan sát có nhiều tiền kỳ giữa (Prometaphase).. - Sốc nhược trương: thời gian sốc nhược trương bố trí trước thời điểm phân bào tối ưu. - Cho rễ non, rễ mầm, lá non hoặc lá mầm vào dung dịch nhược trương citrate natri (C 6 H 5 Na 3 O 7 ) với nồng độ và 0,3% trong thời gian 30 - 45 phút, 45 – 60 phút.. - Cố định mẫu: Mẫu sau khi xử lý sốc nhược trương được cố định bằng dung dịch Carnoy biến đổi trong 4 giờ. - Ép nhẹ tiêu bản cho các tế bào được dàn đều ra.. - Khảo sát số lượng nhiễm sắc thể: chụp ảnh 30 tế bào khác nhau ở kỳ giữa hoặc ở kỳ sau có nhiễm sắc thể phân tán, đếm số lượng nhiễm sắc thể (sử dụng phần mềm photoshop để tăng độ tương phản) và kiểm định giá trị trung bình với độ tin cậy 1. - Thí nghiệm 2: Xử lý sốc nhược trương và thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để khảo sát số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào động vật. - Sốc nhược trương: Cho đôi tuyến nước bọt vào dung dịch NaCl trong 10 phút.. - Đậy lammelle nhẹ nhàng để các tế bào trải đều trên lame (không ép vở tế bào). - Sốc nhược trương: Cho tuyến tinh của châu chấu vào dung dịch NaCl trong thời gian 10 phút.. - Các tiêu bản hiển vi tạm thời của tế bào động vật và tế bào thực vật có nhiễm sắc thể phân tán trong tế bào được chuyển thành tiêu bản hiển vi cố định qua các giai đoạn: tách lammelle và phân hóa màu, khử nước, làm trong mẫu và dán mẫu.. - 3.1 Xử lý sốc nhược trương và khảo sát số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào thực vật Xác định thời điểm phân bào tối ưu ở các loài. - Nếu thu mẫu và cố định trước thời điểm phân bào tối ưu: phần lớn tế bào quan sát trên tiêu bản đang ở giai đoạn kỳ trung gian và kỳ trước.. - Nếu thu mẫu và cố định trong thời điểm phân bào tối ưu thì trên 1 tiêu bản có tất cả các giai đoạn của quá trình phân bào, nhiều kỳ giữa và kỳ sau, ít tế bào đang ở giai đoạn kỳ trung gian và kỳ trước.. - Nếu thu mẫu và cố định sau thời điểm phân bào tối ưu: phần lớn tế bào quan sát trên tiêu bản đang ở giai đoạn kỳ cuối và kỳ trung gian.. - Xác định nồng độ và thời gian gây sốc nhược trương. - Khi không xử l ý sốc nhược trương, các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa tập trung ở mặt phẳng xích đạo, rất ít tế bào có nhiễm sắc thể phân tán ở giai đoạn tiền kỳ giữa (Hình 1).. - Hình 1: Tế bào ở kỳ giữa khi không xử lý sốc nhược trương (X1.000). - Trước khi cố định, mẫu vật được xử lý sốc nhược trương với citrate natri ở các nồng độ và thời gian khác nhau. - Khi xử lý mẫu bằng citrate natri ở các nồng độ 0,5% và 0,6% trong thời gian 30 phút – 60 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, kết quả chưa gây sốc nhược trương (nhiễm sắc thể phân tán nhưng còn chồng lên nhau) (Hình 2).. - Hình 2: Tế bào chưa gây sốc nhược trương (X1.000). - Xử lý mẫu bằng citrate natri 0,4% trong thời gian 30 phút – 45 phút, ở nhiệt độ phòng thí nghiệm đã gây sốc nhược trương (tế bào trương lên và nhiễm sắc thể phân tán trong tế bào). - aureum Nichols) và chóc bạc (Syngonium podophyllum Schott), xử lý sốc nhược trương bằng citrate natri 0,4% trong thời gian là 45 phút - 60 phút cho kết quả tốt hơn 30 phút - 45 phút.. - Rễ mầm dưa hấu tiểu hắc long hạt lép và lá mầm đậu hà lan được xác định có thời điểm phân bào có nhiều tiền kỳ giữa sớm nên thời gian sốc nhược trương khoảng 35- 40 phút trong citrate natri 0,3%.. - Các tế bào thực vật đã được xử lý sốc nhược trương ở kỳ giữa có các nhiễm sắc thể phân tán ở hình 3:. - Hình 3: Tế bào có nhiễm sắc thể phân tán sau khi xử lý sốc nhược trương (X1.000) a. - Mẫu vật trong môi trường nhược trương quá lâu (>90 phút), tế bào trương nhưng khó nhận diện nhân và nhiễm sắc thể (Hình 4).. - Hình 4: Tế bào khi xử lý sốc nhược trương quá lâu (X1.000). - Theo Trần Công Khánh (1980), khi nghiên cứu tế bào và mô thực vật, cần sử dụng các dung dịch sinh lý để nuôi sống tế bào như dung dịch Knop hoặc các dung dịch dùng cho động vật như Ringer, Locke, Tyrode. - Để khảo sát số lượng nhiễm sắc thể, tế bào thực vật được xử lý nhược trương trong KCl 0,075M (Ruiyang et al., 1982) hoặc trong dung dịch nhược trương Ohnuki (55 mM KC1, 55mM NaNO 3 and 55mM NaC 2 H 3 O 2 tỉ lệ 10:5:2). - Trong nghiên cứu này, citrate natri cũng có hiệu quả gây sốc nhược trương ở tế bào thực vật làm nhiễm sắc thể phân tán trong tế bào, tuy nhiên khi gây sốc nhược trương trong dung dịch có nồng độ thấp và thời gian kéo dài làm nhiễm sắc thể biến dạng.. - Khảo sát số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào thực vật: Số lượng nhiễm sắc thể trong các tế bào khảo sát liệt kê ở bảng 1.. - Bảng 1: Số lượng nhiễm sắc thể ở các loài thực vật. - 3.2 Xử lý sốc nhược trương ở tế bào động vật và khảo sát số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào động vật. - 3.2.1 Tế bào sinh dục đực châu chấu (Acrida Linnaeus, 1758). - Ở tế bào sinh dục đực châu chấu (Acrida Linnaeus, 1758) khi cố định ở các thời điểm khác nhau trong ngày đều quan sát được các giai đoạn của quá trình giảm phân.. - Theo Sharma (1966), dung dịch NaCl 0,73% môi trường đẳng trương đối với tế bào sinh dục đực của châu chấu. - Nếu tách tuyến sinh dục trong môi trường NaCl 0,73% rồi cố định để thực hiện tiêu bản thì các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa thường tập trung ở mặt phẳng xích đạo và nhiễm sắc thể giới tính X dạng que không nằm trên mặt phẳng xích đạo (Hình 5a). - Đôi khi có tế bào có nhiễm sắc thể phân tán.. - Khi tách tuyến sinh dục châu chấu (Acrida Linnaeus, 1758) trong môi trường đẳng trương rồi xử lý nhược trương bằng NaCl 0,6% và 0,5% trong 10 phút trước khi cố định, kết quả cho thấy tế bào trương nhưng không vỡ, các nhiễm sắc thể phân tán trong tế bào nhưng còn chồng nhau.. - Khi tách tuyến sinh dục châu chấu trong môi trường đẳng trương rồi xử lý nhược trương bằng NaCl 0,4% trong 10 phút trước khi cố định, kết quả cho thấy tế bào trương, nhiễm sắc thể phân tán rõ. - Ở kỳ sau I, mỗi cực tế bào gồm 11 cặp nhiễm sắc thể thường (2 cặp hình dạng hạt, 9 cặp hình que dài ngắn khác nhau) và 1 nhiễm sắc thể giới tính X dạng que (hoặc không có) (Hình 5b).. - Ở kỳ giữa II quan sát được 11 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 nhiễm sắc thể giới tính X dạng que (Hình 5c). - Ở kỳ sau II, tại mỗi cực tế bào quan sát 11 nhiễm sắc thể đơn hoặc 12 nhiễm sắc thể đơn (Hình 5d).. - Hình 5: Tế bào và nhiễm sắc thể của châu chấu (Acrida Linnaeus, 1758) (X1.000) a. - Tế bào khi không xử lý nhược trương, b. - Tế bào ở sau I, c. - Tế bào ở kỳ giữa II, d. - 1 cực tế bào ở kỳ sau II (11 nhiễm sắc thể đơn). - Khi tách tuyến sinh dục châu chấu trong môi trường đẳng trương rồi xử lý nhược trương bằng NaCl 0,3%, kết quả cho thấy nhiều tế bào vỡ ra, gây lạc nhiễm sắc thể.. - 3.2.2 Tế bào tuyến nước bọt ruồi giấm (Drosophila sp.). - Khi tách tuyến nước bọt trong môi trường này rồi cố định và thực hiện tiêu bản, kết quả cho thấy muốn quan sát rõ hình dạng nhiễm sắc thể cần phải ép vỡ tế bào.. - Nếu tách tuyến nước bọt trong môi trường đẳng trương NaCl 0,73% rồi xử l ý nhược trương trong NaCl 0,6% trước khi cố định rồi thực hiện tiêu bản, kết quả cho thấy tế bào trương lên nhưng chưa quan sát rõ hình dạng của nhiễm sắc thể trong tế bào.. - Khi tách tuyến nước bọt trong môi trường đẳng trương NaCl 0,73% rồi xử l ý nhược trương trong NaCl 0,5% trong 10 phút trước khi cố định rồi thực hiện tiêu bản, kết quả cho thấy tế bào trương lên và quan sát được hình dạng của 1 nhiễm sắc thể khổng lồ trong mỗi tế bào không bị vở. - Mỗi nhiễm sắc thể khổng lồ có các dãy tỏa ra ở vùng tâm động (có thể quan sát 5 dãy dài và 1 dãy ngắn).. - Trên mỗi dãy nhiễm sắc thể có vùng dị nhiễm sắc xen lẫn vùng đồng nhiễm sắc và vùng búp hóa (Hình 6). - Kết quả tương tự nhiễm sắc thể khổng lồ như Nguyễn Như Hiền (2006) đã mô tả.. - Hình 6: Tuyến nước bọt và nhiễm sắc thể khổng lồ trong mỗi tế bào của tuyến nước bọt (X1.000). - Các tế bào của tuyến nước bọt, c. - Nhiễm sắc thể khổng lồ trong 1 tế bào, d. - Vùng đồng nhiễm sắc và vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể khổng lồ, e. - Khi tách tuyến nước bọt trong môi trường đẳng trương NaCl 0,73% rồi xử l ý nhược trương trong NaCl 0,3 % trong 10 phút, kết quả quan sát cho thấy nhiều tế bào vỡ ra.. - 3.2.3 Tế bào não của ấu trùng ruồi giấm (Drosophila sp.). - Khi tách não trong môi trường đẳng trương NaCl 0,73% rồi xử l ý nhược trương trong NaCl 0,6% trong 10 phút, kết quả cho thấy nhiễm sắc thể chưa phân tán (Hình 7a).. - Khi tách não trong môi trường đẳng trương NaCl 0,73% rồi xử l ý nhược trương trong NaCl 0,5% trong 10 phút, kết quả cho thấy nhiễm sắc thể phân tán trong tế bào.. - Hình 7: Tế bào chưa gây sốc nhược trương (X1.000). - Tế bào não ấu trùng ruồi giấm (Drosophila sp.) khi xử lý NaCl 0,6%, b và c). - Tế bào não ấu trùng ruồi giấm khi xử lý NaCl 0,5%. - Ở ruồi giấm, số nhiễm sắc thể trong tế bào thay đổi tùy loài. - Ở Drosophila melanogaster bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 8. - (1997), bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của Drosophila gani là 2n = 12 và ở Drosophila okadai 2n = 12. - Kết quả quan sát tiêu bản ở ruồi giấm thu trong môi trường tự nhiên (Drosophila sp.) này có bộ nhiễm sắc thể 2n = 8. - Để khảo sát hình dạng của nhiễm sắc thể cần nhuộm nhiễm sắc thể theo phương pháp nhuộm C-band.. - Khi tách não trong môi trường đẳng trương NaCl 0,73% rồi xử l ý sốc nhược trương trong NaCl 0,4% và 0,3% trong 10 phút kết quả cho thấy tế bào bị vở, nhiễm sắc thể bị lạc.. - Ở tế bào động vật, theo các nghiên cứu khác, các loại hóa chất được sử dụng gây sốc nhược trương ở là citrate natri (Meredith, 1996) hoặc KCl (Mesa et al., 1990).. - Trong nghiên cứu này, NaCl được sử dụng để gây sốc nhược trương cũng có hiệu quả làm phân tán nhiễm sắc thể trong tế bào.. - Tiêu bản cố định cần đạt về yêu câu: tế bào không teo, màu tương phản, giữ màu lâu, quan sát được nhiễm sắc thể.. - Ở tế bào thực vật (rễ non, lá non, rễ mầm và lá mầm) của hành ta (Allium ascalonicum L. - dưa hấu lai F1 TN736 tiểu hắc long hạt lép, chuối nhà và 9 loài thực vật thuộc họ ráy (Araceae) khi được xử lý bằng citrate natri (C 6 H 5 Na 3 O 7 ) 0,4% trong thời gian 30 - 60 phút (tùy loài) trước khi cố định để thực hiện tiêu bản hiển vi đã gây được sốc nhược trương tế bào. - Ở tế bào sinh dưỡng của động vật như não, tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm (Drosophila sp.) được xử lý bằng NaCl 0,5% và tế bào sinh dục của châu chấu đực (Acrida Linnaeus, 1758) được xử lý bằng NaCl 0,4% trong thời gian 10 phút trước khi cố định cũng gây được sốc nhược trương. - Sốc nhược trương ý nghĩa trong việc làm phân tán nhiễm sắc thể nhưng cũng có khuynh hướng làm tế bào và nhiễm sắc thể tổn thương. - Số lượng nhiễm sắc thể của các loài nghiên cứu đã được khảo sát. - Qui trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời và cố định của tế bào động vật và tế bào thực vật đã được sốc nhược trương cũng được xác định.. - Sinh học tế bào