- KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU NGẢI SẬY (ZINGIBER MONTANUM). - Ba phương pháp trích ly tinh dầu từ củ Ngải sậy thu hái tại Bảy Núi, tỉnh An Giang đã được nghiên cứu bao gồm phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp (NSC-1), phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp (NSC-2) và phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng (NSC-3).. - Hiệu suất tinh dầu thu được trong hai phương pháp NSC-2 và NSC-3 là khá giống nhau (lần lượt là 1,439% và 1,423%) và cao hơn so với phương pháp NSC-1 (1,261. - Bên cạnh đó, tinh dầu thân và lá Ngải sậy cũng được trích ly bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp nhưng hiệu suất không đáng kể (tương ứng là 6x10 -3 % và 4,33x10 -3. - Kết quả phân tích bằng phương pháp GC-MS cho thấy thành phần tinh dầu củ thu được trong cả ba phương pháp chủ yếu bao gồm 4-terpinenol (27 - 35. - Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy tinh dầu củ Ngải sậy thu được có hoạt tính kháng oxi hóa không đáng kể khi so với vitamin C nhưng tốt hơn tinh dầu Nghệ nhà và Long não. - Ngải Sậy cũng thuộc họ Gừng, có tên khoa học là Zingiber montanum. - Các kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy tinh dầu Ngải Sậy có rất nhiều hoạt tính sinh học quý như kháng nấm (Md. - Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của tinh dầu Ngải Sậy còn rất hạn chế. - Đáng chú ý là công trình nghiên cứu của Trần Công Luận và ctv đã đạt được những thành công bước đầu trong việc nghiên cứu khả năng kháng ung thư và kháng nấm của tinh dầu Ngải sậy. - Từ đó cho thấy việc nghiên cứu quy trình trích ly, xác định thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của tinh dầu Ngải Sậy có ý nghĩa quan trọng cả về mặt khoa học lẫn thực tiễn, góp phần vào hướng nghiên cứu tận dụng những nguồn nguyên liệu sẵn có để tạo ra các sản phẩm tinh dầu thiên nhiên chất lượng cao, giá thành thấp, nhằm phục vụ tốt hơn nhu cầu cuộc sống. - Từ công trình nghiên cứu của nhóm tác giả này, đề tài phát triển hoàn thiện thêm việc nghiên cứu tinh dầu Ngải sậy bằng cách mở rộng nghiên cứu trên thân và lá Ngải sậy. - Thêm vào đó là xây dựng quy trình trích ly tinh dầu Ngải sậy theo ba phương pháp là chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp, gián tiếp và có sự hỗ trợ của vi sóng ở quy mô phòng thí nghiệm. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM. - Nguyên liệu được sử dụng là thân, lá và củ Ngải sậy (Zingiber montanum) được thu mua trực tiếp tại vườn ở Bảy Núi, An Giang và được định danh tại Bộ môn Sinh, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ và tham chiếu với tài liệu tham khảo (Nguyễn Thị Kim Huê, 2009). - Toàn bộ cây Ngải sậy sau khi thu mua về được rửa sạch bùn. - 2.2.1 Trích ly tinh dầu từ củ Ngải sậy. - Ở mỗi phương pháp trích ly, sau khi quá trình chưng cất kết thúc thu lấy hoàn toàn cột nước và tinh dầu vào bình tam giác, để nguội. - Tiến hành chiết tách tinh dầu bằng diethyl ether, làm khan bằng Na 2 SO 4 , lọc, cô đuổi dung môi để thu tinh dầu sản phẩm. - Chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp (NSC-1). - Củ Ngải sậy có độ ẩm 7,53% được xay nhuyễn.. - Cân 200 g mẫu, cho vào bình cầu cùng với 500 mL nước cất hai lần, lắp hệ thống chưng cất hoàn chỉnh và tiến hành chưng cất tinh dầu trong 2,5 giờ. - Hiệu suất tinh dầu thu được theo phương pháp này là 1,261%.. - Tiến hành chưng cất tinh dầu trong 12 giờ. - Hiệu suất tinh dầu thu được theo phương pháp này là 1,423%.. - Hiệu suất tinh dầu thu được theo phương pháp này là 1,439%.. - 2.2.2 Phân tích thành phần tinh dầu bằng kỹ thuật GC/MS. - Thành phần hóa học của tinh dầu củ Ngải sậy được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ trên máy GC-MS của hãng Thermo Scientific tại Bộ môn Hóa, Khoa Khoa học Tự nhiên. - 2.2.3 Phân tích chỉ số vật lý và hóa học của tinh dầu. - Tinh dầu củ Ngải sậy trích ly từ 3 phương pháp sau khi được xác định thành phần hóa học, tiếp tục được xác định các chỉ số vật lí và hóa học như tỷ trọng (d), góc quay cực. - 2.2.4 Xác định khả năng kháng oxy hóa Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). - Lập đồ thị biểu hiện mối tương quan giữa SC và thể tích mẫu thử đã dùng, từ đó tính được giá trị EC 50 của tinh dầu.. - 2.2.5 Xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn được kiểm định theo phương pháp khuếch tán trong bản thạch, thực hiện ở Phòng kiểm nghiệm Hóa – Lý – Vi sinh, Viện Pasteur, Thành phố Hồ Chí Minh và phương pháp pha loãng đa nồng độ để xác định IC 50 , thực hiện ở Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.. - 2.2.6 Xác định độc tính trên tế bào ung thư Thử nghiệm độc tính trên tế bào của tinh dầu củ Ngải sậy ly trích từ 3 phương pháp được thực hiện trên 4 dòng tế bào ung thư: ung thư vú (MCF-7), ung thư vú đa kháng thuốc (MCF7/ADR), ung thư xuất phát từ biểu mô tuyến (MDA-MB-231), ung thư cổ tử cung (Hela) bằng phương pháp MTT.. - Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) được mô tả như sau: các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng có mật độ 5000 tế bào/giếng, với môi trường nuôi cấy là DMEM high glucose, 10% FBS, 1% A/A, ủ ở nhiệt độ 37°C, 5%. - Tế bào được xử lý với tinh dầu Ngải sậy pha loãng bằng dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau và đảm bảo nồng độ cuối của DMSO trong môi trường nuôi cấy không vượt quá 0,05% (v/v) để tránh gây độc dung môi. - Thành phần phần trăm của tế bào sống sót biểu thị độc tính của tinh dầu Ngải sậy, khi độc tính càng cao thì số lượng tế bào sống sót càng thấp. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Trích ly tinh dầu từ củ Ngải sậy. - Ba phương pháp trích ly tinh dầu từ củ Ngải sậy ở quy mô phòng thí nghiệm được tiến hành khảo sát bao gồm: trích ly theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp với bộ Clevenger (NSC-1). - trích ly theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp (NSC-2) và trích ly bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng (NSC-3).. - Ở phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp (NSC-1): Tiến hành khảo sát ba yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất tinh dầu trích ly bao gồm thể tích nước cất (mL), thời gian chưng cất (giờ) và cách xử lý mẫu (xay nhuyễn và xắt nhỏ) bằng cách cố định hai yếu tố và thay đổi yếu tố khảo sát để xác định giá trị tốt nhất. - Trong điều kiện này, hiệu suất tinh dầu thu được tương ứng là 1,261. - Để xây dựng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp (NSC-2), đề tài tiến hành cố định hai yếu tố đã được xác định là tốt nhất từ quy trình trích ly (NSC-1) là thể tích nước cất (500 mL) và cách xử lý mẫu (xay nhuyễn), thay đổi thời gian chưng cất lần lượt ở các giá trị và 14 giờ. - Kết quả cho thấy, thời gian 12 giờ là khoảng thời gian tốt nhất ứng với hiệu suất tinh dầu thu được là 1,423. - Đối với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng (NSC-3), đề tài tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất tinh dầu củ Ngải sậy bao gồm công suất lò vi sóng (W), thể tích nước cất (mL), thời gian chưng cất (giờ) bằng cách cố định hai yếu tố và thay đổi một yếu tố ở nhiều giá trị, đồng thời giữ nguyên giá trị của yếu tố đã được xác định là tốt nhất từ quy trình ly trích tinh dầu bằng phương pháp (NSC-1) là cách xử lý mẫu (xay nhuyễn). - Điều kiện tốt nhất tìm được cho ba quy trình trích ly tinh dầu củ Ngải sậy và hiệu suất tinh dầu thu được tương ứng được tóm tắt trong Bảng 2.. - Bảng 2: Điều kiện tốt nhất cho quá trình ly trích tinh dầu củ Ngải sậy Phương. - Thời gian chưng cất (giờ). - Hiệu suất tinh dầu. - Từ Bảng 2 cho thấy hiệu suất tinh dầu củ Ngải sậy thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp (NSC-2) tuy cao hơn so với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp (NSC-1) nhưng đòi hỏi thời gian chưng cất rất dài (12 giờ). - Trong khi đó, phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng (NSC-3) cần thời gian chưng cất ngắn nhất đồng thời cho hiệu suất tinh dầu cao nhất trong cả ba phương pháp.. - 3.2 Trích ly tinh dầu từ thân và lá Ngải sậy Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp được áp dụng để trích ly tinh dầu từ thân và lá Ngải sậy. - Thí nghiệm được lặp lại ba lần, mỗi lần với 300 g thân hoặc lá Ngải sậy đã được xử lý sơ. - Kết quả cho thấy: hiệu suất tinh dầu thân và lá thu được theo phương pháp này lần lượt là 6x10 -3 và 4,33x10 -3. - Từ đây cho thấy, thân và lá Ngải sậy có hàm lượng tinh dầu rất thấp, không đáng kể so với củ Ngải sậy. - Chính vì vậy, đề tài chỉ tiến hành phân tích thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của tinh dầu từ củ Ngải sậy.. - 3.3 Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu củ Ngải sậy. - Thành phần hóa học của tinh dầu củ Ngải sậy được tiến hành phân tích bằng phương pháp GC-. - Nhìn chung có sự khác biệt về thành phần của tinh dầu trích ly được ở ba phương pháp nghiên cứu. - Tuy nhiên, thành phần nhiều nhất trong tinh dầu củ. - Ngải sậy thu được bằng cả ba phương pháp là giống nhau bao gồm 4-terpinenol (27 – 35. - Bảng 3: Thành phần hóa học của tinh dầu củ Ngải sậy. - 3.4 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu củ Ngải sậy. - Một số chỉ tiêu hóa lý quan trọng của tinh dầu củ Ngải sậy như tỷ trọng, góc quay cực, chỉ số acid, chỉ số savon hóa và chỉ số ester được tiến hành phân tích. - Nhìn chung, tinh dầu củ Ngải sậy trích ly từ ba phương pháp khác nhau có sự khác nhau về chỉ số vật lý, hóa học. - Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích thành phần hóa học của ba mẫu tinh dầu thu được: thành phần hóa học khác nhau dẫn đến các tính chất hóa lý như góc quay cực, chỉ số acid, chỉ số savon và chỉ số ester cũng khác nhau.. - Bảng 4: Chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu củ Ngải sậy. - Chỉ số savon hóa Chỉ số ester Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu củ Ngải sậy. - 3.5.1 Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH. - Hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu củ Ngải sậy được xác định bằng phương pháp DPPH. - quả tính được giá trị EC 50 của tinh dầu củ Ngải sậy và so sánh với giá trị EC 50 của chất đối chứng là vitamin C và một số loại tinh dầu khác (Sara Albino Antunes et al., 2012) được trình bày trong Bảng 5.. - Bảng 5: Giá trị EC 50 của các loại tinh dầu và vitamin C. - Từ đây cho thấy các loại tinh dầu khảo sát đều có hoạt tính kháng oxy hóa không đáng kể so với vitamin C, một hợp chất được biết có hoạt tính kháng oxi hóa rất tốt và có nhiều ứng dụng thương. - Tuy nhiên, so với hai loại tinh dầu khảo sát thì tinh dầu củ Ngải sậy có hoạt tính kháng oxi hóa tốt hơn và tốt nhất là tinh dầu củ Ngải sậy trích ly từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng (NSC-3).. - 3.5.2 Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn a. - Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đo đường kính vòng ức chế. - Do thành phần hóa học của cả ba loại tinh dầu khá giống nhau nên đề tài tiến hành khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn trên mẫu tinh dầu NSC-1 bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đo đường kính vùng ức chế để sàng lọc sơ bộ trước.. - Tinh dầu thử nghiệm bao gồm tinh dầu nguyên chất C o và tinh dầu pha loãng trong 1 thể tích dimethyl sulfoxide, theo thứ tự lần lượt là C 1 , C 2 , C 3 , C 4 . - Bảng 6: Giá trị đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu củ Ngải sây. - Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ xác định IC 50. - Qua kết quả khảo sát khả năng kháng nấm, kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đo đường kính vùng ức chế có thể. - nhận thấy tinh dầu củ Ngải sậy có dấu hiệu diệt một số chủng vi khuẩn và nấm kiểm định. - Chính vì vậy, đề tài tiếp tục xác định giá trị IC 50 của tinh dầu củ Ngải sậy trích ly được từ ba phương pháp để có kết luận chính xác. - Bảng 7: Giá trị IC 50 của tinh dầu củ Ngải sậy. - Bảng 7 cho thấy tinh dầu củ Ngải sậy trích ly từ ba phương pháp không có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn và vi nấm thử nghiệm.. - 3.5.3 Xác định độc tính với tế bào ung thư Ba mẫu tinh dầu củ Ngải sậy được tiến hành. - Bảng 8: Độc tính với tế bào ung thư của tinh dầu củ Ngải sậy. - Nếu mẫu tinh dầu nào có giá trị IC 50 thấp hơn, tức nồng độ ức chế 50% thấp hơn thì tinh dầu đó có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn.. - Ở đây, cả ba mẫu tinh dầu đều có IC 50 <. - 20 µg/mL cho thấy các mẫu tinh dầu này đều có tiềm năng kháng ung thư. - Tuy nhiên, hai mẫu tinh dầu củ Ngải sậy NSC-2 và NSC-3 có hoạt tính gây độc đối với tế bào cao hơn so với mẫu tinh dầu NSC-1.. - Đặc biệt, hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai mẫu tinh dầu củ Ngải sậy NSC-2 và NSC-3 xấp xỉ so với đối chứng dương 4-hydroxytamoxifen, một mô hình thụ thể estrogen chọn lọc được ứng dụng trong điều trị ung thư vú và phẫu thuật điều trị ung thư vú hiện nay.. - Khảo sát tinh dầu Ngải sậy trồng ở Bảy Núi, An Giang cho các kết quả như sau:. - Hiệu suất tinh dầu ở thân và lá Ngải sậy không đáng kể so với phần củ.. - Đối với củ Ngải sậy, phương pháp chưng cất lôi cuốn có sự hỗ trợ của vi sóng (NSC-3) cho hiệu suất tinh dầu cao nhất trong thời gian ngắn nhất trong cả ba phương pháp nghiên cứu.. - Tinh dầu củ Ngải sậy trích ly từ ba phương pháp khác nhau đều có ba thành phần chính là 4- terpinenol (27 – 35. - Tinh dầu củ Ngải sậy không có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn đối với các chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm và hoạt tính kháng oxy hóa không đáng kể so với Vitamin C, nhưng tốt hơn tinh dầu Long não và tinh dầu Nghệ nhà.. - Tinh dầu củ Ngải sậy có hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư: ung thư vú (MCF-7), ung thư vú đa kháng thuốc (MCF7/ADR), ung thư biểu mô tuyến (MDA-MB-231) và ung thư cổ tử cung (Hela). - Nhóm tác giả xin chân thành cám ơn cô Hà Thị Kim Quy và Giáo sư Oh Won Keun (Khoa Dược – Trường Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã hỗ trợ khảo sát thử nghiệm hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư của tinh dầu củ Ngải sậy.. - Thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của tinh dầu ba loài ngải sậy An Giang