- KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC VI KHUẨN ACID LACTIC PHÂN LẬP TỪ CƠM MẺ Ở BA VÙNG SINH THÁI. - Sáu mươi lăm dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MRS từ 18 mẫu cơm mẻ ở ba vùng sinh thái của Đồng Bằng Sông Cửu Long. - Phần lớn khuẩn lạc của chúng có dạng tròn, láng màu trắng đục đến trắng trong và những dòng vi khuẩn này có dạng que ngắn đến que dài, đơn hoặc kết đôi hoặc kết chuỗi. - Tất cả vi khuẩn đều Gram dương, Catalase âm tính, Oxidase âm tính, Indole âm tính, không có khả năng chuyển động. - Kết quả so sánh trình tự tương đồng cho thấy Các dòng B3.21n, AG.4, S3.111, K1.61, TCM1.42 và TA6 tương đồng với các dòng tương ứng trên cơ sở dữ liệu NCBI gồm: L. - Sản phẩm của những vi khuẩn lactic được ứng dụng. - Câu hỏi được đặt ra là những yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến tính đa dạng sinh học của vi khuẩn lactic không? Và như thế trong cơm mẻ ở các vùng sinh thái khác nhau hệ vi khuẩn lactic có khác nhau hay không? Đề tài “Khảo sát tínhđa dạng sinh học vi khuẩn acid lactic từ cơm mẻ ở ba vùng sinh thái của Đồng Bằng Sông Cửu Long” đã được thực hiện với mục tiêu:. - Phân lập các dòng vi khuẩn lactic trong cơm mẻ.. - Đánh giá khả năng lên men lactic của các dòng vi khuẩn lactic phân lập được.. - Định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả nănglên men lacticcao.. - Mẫu cơm mẻ được thu từ các tỉnh khác nhau như: Cà Mau, Kiên Giang đại diện cho vùng sinh thái nước mặn. - Mỗi tỉnh thu 3 mẫu cơm mẻ ở những nơi khác nhau mang về phòng thí nghiệm và trữ ở 4 o C cho đến khi phân lập.. - 2.2 Xác định thành phần hóa lý trong cơm mẻ. - Phân tích thành phần dinh dưỡng: Các mẫu cơm mẻ được xác định:. - 2.3 Phân lập vi khuẩn acid lactic từ cơm mẻ Quy trình phân lập theo Oyetayo (2004) Chuẩn bị mẫu: Cân khoảng 5 g cơm mẻ cho vào bình tam giác có dung tích 250 ml chứa 50 ml môi trường lỏng MRS. - Xác định sơ bộ vi khuẩn: dựa vào hình dạng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc.. - Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.. - Chỉ tiêu chọn: chỉ chọn những vi khuẩn có đặc tính như: dạng trực khuẩn, hình que hay hình cầu, dạng đơn hay kết chuỗi.. - Dựa vào các đặc tính sinh hóa chuyên biệt để chọn lọc những dòng vi khuẩn acid lactic đã phân lập được.. - So sánh khuẩn lạc các dòng vi khuẩn acid lactic phân lập được giữa các vùng sinh thái khác nhauvề hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, dạng bìa, độ nổi, kích thước khuẩn lạc.. - 2.4 Kiểm tra khả năng sinh acid tổng của các dòng vi khuẩn acid lactic (Collin, 1989). - Sáu mươi lăm (65) dòng vi khuẩn acid lactic phân lập được nhân mật số trong ống nghiệm chứa môi trường MRS broth, ủ ở 30 °C, trong 24 giờ đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu.. - Dung dịch để tiến hành lên men (100 ml/1 bình) được khử trùng ở 121°C trong 20 phút, để nguội khoảng 37 °C, chủng 1% các dòng vi khuẩn vào.. - Vi khuẩn acid lactic tạo ra hàm lượng acid trong dịch lên men, độ pH đạt thấp nhất trong khoảng thời gian ngắn nhất.. - Các chỉ tiêu phân tích vào thời điểm giờ sau khi chủng vi khuẩn: xác định hàm lượng acid lactic trong dịch lên men.. - Chọn một số dòng vi khuẩn acid lactic đại diện của mỗi vùng sinh thái có lượng acid lactic sinh ra cao và khác nhau được dùng để tinh sạch DNA chuẩn bị cho các bước tiếp theo.. - 2.5 Nhận diện các dòng vi khuẩn acid lactic đã phân lập bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Ly trích DNA của các dòng vi khuẩn acid lactic đã phân lập. - Sau khi nuôi vi khuẩn thuần trong ống nghiệm chứa môi trường lỏng MRS để thu sinh khối, tiến hành trích DNA của vi khuẩn.. - Các mẫu DNA của vi khuẩn sau khi ly trích, sẽ tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi (universal primer của rDNA vi khuẩn) khuếch đại trình tự gen 16S rDNA: 8F làm mồi xuôi và 1391R làm mồi ngược có trình tự như sau (Maniatis et al., 1989):. - 3.1 Nguồn gốc mẫu cơm mẻ phân lập các dòng vi khuẩn. - Trong 65 dòng vi khuẩn phân lập được có 40/65 (chiếm 61,53%) dòng vi khuẩn phân lập từ cơm mẻ nuôi ở gia đình, sử dụng gạo, nguồn nước… ở địa phương để làm. - 25/65 (chiếm 38,47%) dòng vi khuẩn mua ở chợ.. - Thành phần hóa học trong Cơm Mẻ pH và ẩm độ. - Thành phần hóa học cơ bản gồm pH và độ ẩm của 18 mẫu cơm mẻ lên men thu thập ở 6 tỉnh thuộc 3 vùng sinh thái của Đồng Bằng Sông Cửu Long được trình bày ở Bảng 2.. - Tóm lại pH giữa các mẫu cơm mẻ dao động từ 2,9 – 3,5. - cơm mẻ là sản phẩm lên men chứa acid rất cao, cho thấy có sự hoạt động rất mạnh mẽ của nhóm vi khuẩn sinh acid mà trong đó chủ yếu là vi khuẩn acid lactic.. - Bảng 1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập Vùng sinh. - mẫu Số dòng phân lập Nước mặn Cà Mau. - của 18 mẫu cơm mẻ. - Bảng 3: Kết quả phân tích hàm lượng dinh dưỡng của 18 mẫu cơm mẻ Tên mẫu. - Hàm lượng. - Kết quả cho thấy dưới hàm lượng đường trong cơm mẻ từ 2,9 – 5,8%. - Sự khác nhau về hàm lượng đường có thể là do thời gian cho mẻ ăn sớm hay muộn và hoạt động tích cực của vi sinh vật mà đặc biệt là vi khuẩn lactic đã lên men lượng đường có trong cơm mẻ để tạo thành. - Hàm lượng lipid đa số trong cơm mẻ rất thấp từ . - Kết quả này cho thấy giữa các vùng sinh thái khác nhau thì hàm lượng lipid trong mẫu cơm mẻ thấp và có sự khác biệt nhau nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về thống kê.. - Hình 1: Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn ở Cà Mau (A), Sóc Trăng (B) và An Giang (C). - Trong 65 dòng vi khuẩn phân lập được ở 3 vùng sinh thái khác nhau có 62/65 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, láng chiếm tỉ lệ dòng có khuẩn lạc tròn, sần chiếm tỉ lệ 4,6%. - 36/65 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc trắng đục chiếm tỉ lệ 55,4%,có 19/65 dòng có màu khuẩn lạc trắng trong chiếm tỉ lệ 29,2%, có 10/65 dòng có màu khuẩn lạc trắng đục bìa trong chiếm tỉ lệ 15,4%. - 60/65 dòng vi khuẩn có bìa khuẩn lạc dạng nguyên chiếm tỉ lệ dòng có bìa khuẩn lạc dạng răng cưa chiếm tỉ lệ 7,7%. - 46/65 dòng vi khuẩn có độ nổi ở dạng mô cao chiếm tỉ lệ dòng có độ nổi ở dạng mô lài bìa chiếm tỉ lệ 29,2%.. - Ở vùng nước ngọt các dòng vi khuẩn phân lập có màu trắng đục, mô cao, đường kính khuẩn lạc lớn từ 1,5 – 2,5 mm chiếm đa số, ở vùng nước lợ các dòng vi khuẩn phân lập được chủ yếu có khuẩn lạc trắng trong, mô cao, kích thước từ 1,0 – 2,0 mm chiếm đa số. - Còn vùng nước mặn các dòng vi khuẩn phân lập được chủ yếu có khuẩn lạc màu trắng đục và trắng trong, mô cao, khuẩn lạc nhỏ từ 1,0 – 1,5 mm chiếm đa số. - Hình 2: Hình dạng tế bào của vi khuẩn (độ phóng đại 100X) ở Cà Mau (A), Sóc Trăng (B) và Cần Thơ (C). - Trong 65 dòng vi khuẩn phân lập được có 19/65 dòng vi khuẩn có tế bào hình que ngắn chiếm tỉ lệ 29,2%, có 22/65 dòng vi khuẩn có tế bào hình que ngắn kết đôi chiếm tỉ lệ 33,9%, có 9/65 dòng vi khuẩn tế bào hình que ngắn kết chuỗi chiếm tỉ lệ 13,9%, có 3/65 dòng vi khuẩn có tế bào hình que ngắn kết đôi cong chiếm tỉ lệ 4,6%, có 1/65 dòng vi khuẩn tế bào hình cầu chiếm tỉ lệ 1,5%, có 11/65 dòng vi khuẩn có tế bào dạng que dài chiếm tỉ lệ 16,9%.. - Vùng nước ngọt chỉ phân lập được một dòng vi khuẩn lactic hình cầu cho thấy trong cơm mẻ chứa nhiều vi khuẩn lactic hình que (giống Lactobacillus). - Tế bào vi khuẩn kết đôi cong chiếm tỉ lệ rất ít và chỉ phân lập ở vùng nước mặn (2 dòng) và vùng nước lợ (1 dòng). - Ở 3 vùng sinh thái đều phân lập đa số tế bào vi khuẩn hình que ngắn 19/65 và que ngắn kết đôi hoặc kết chuỗi 32/65, chỉ có một số ít tế bào hình que dài 10/65. - Vì vậy, có thể kết luận được rằng 64 dòng vi khuẩn có hình que phân lập được từ cơm mẻ lên men thu ở 6 tỉnh, thành phố thuộc 3 vùng sinh thái ĐBSCL (Cần Thơ,. - An Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Kiên Giang, Cà Mau) là vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus và 1 dòng vi khuẩn lactic hình cầu không thuộc giống Lactobacillus.. - Kết quả nhuộm gram cho thấy tế bào của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều bắt màu tím xanh của thuốc nhuộm của Crystal Violet chứ không bắt màu đỏ của Fushin. - Qua đó cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập được đều là vi khuẩn gram dương.. - Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường MRS agar sau 48 giờ cấy sẽ được chọn kiểm tra sự hiện diện của enzyme catalase và cytochrome oxidase. - Khi được thử với H 2 O 2 3%, khuẩn lạc của tất cả các dòng đều không có hiện tượng sủi bọt khí, chứng tỏ các dòng đều không có hệ enzyme catalase để phân giải H 2 O 2 3% thành nước và oxy hay nói cách khác là các dòng vi khuẩn phân lập có catalase âm tính.. - Tất cả các dòng phân lập đều cho kết quả oxidase âm tính vì khi được kiểm tra với giấy lọc có tẩm thuốc thử Tetramethyl - p - phenylendiamin dihydrochlorid, khuẩn lạc của tất cả các dòng đều không làm đổi màu của giấy lọc từ trắng sang xanh. - Kiểm tra khả năng hình thành indole từ tryptophan của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho kết quả indole âm tính với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminobenzaldehyde (pDMABA). - Các dòng vi khuẩn phân lập đều không tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ.. - 3.3 So sánh khả năng lên men lactic của các dòng vi khuẩn acid lactic ở ba vùng sinh thái. - Sau khi chủng vi khuẩn 24 giờ, hàm lượng acid lactic của các dòng vi khuẩn tăng nhanh, đạt cao nhất ở các dòng TA6, K1.6 1 , S2.1 1 , TCM1.2n, TCM1.42, S3.11 1 khoảng 15-16g/l và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng vi khuẩn còn lại. - Từ 72h thì hàm lượng acid lactic của các dòng vi khuẩn tăng chậm lại đến 96h, từ 96h trở đi một số dòng vi khuẩn có hàm lượng acid lactic tăng rất. - ít đến 144h, một số dòng hàm lượng acid lactic còn có xu hướng giảm nhẹ như các dòng A3.4N, A3.3, AG5, K1.2 1 , K1.8, K2.1, K2.3, K3.1, K3.8, K3.3n, CM1.5 1 , B1.7 2 , B1.3 1 n, B3.2 1 n, S2.1 1 , S2.1, S3.3 1 , O2.3, O2.3 4 , O2.3 3 , TA6, A2.2 1 . - Trong 65 dòng vi khuẩn phân lập có 3 dòng vi khuẩn có khả năng lên men tạo acid thấp nhất khoảng g/l là các dòng A3.3, O3.7, O3.7n.. - Khả năng lên men lactic của các dòng vi khuẩn đạt cao nhất từ 48h- 96h. - Điều này chứng tỏ sinh khối của các dòng vi khuẩn tăng cao nhất vào lúc 48h – 96h. - Giữa các dòng vi khuẩn phân lập từ ba vùng sinh thái nước măn, lợ, ngọt có khả năng lên men lactic khác nhau.. - Trong đó mẫu O3 pH= 3,5 là cao nhất, kết quả phân lập được 2 dòng O3.7 và O3.7n cũng có khả năng lên men lactic thấp nhất khoảng g/l, lượng đường cao nhất. - Những mẫu còn lại có pH thấp kết quả phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng len men lactic cao hơn khoảng 18- 20g/l. - Từ đó cho thấy pH, ẩm độ, hàm lượng dinh dưỡng có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic.. - 3.4 Nhận diện các dòng vi khuẩn acid lactic đã phân lập bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR của 18/18 dòng vi khuẩn acid lactic trên đều có băng DNA nằm trong khoảng 1200bp (Hình 3).. - Hình 3: Sản phẩm PCR của một số dòng vi khuẩn phân lập được. - Kết quả giải trình tự của 6 dòng vi khuẩn acid lactic phân lập bằng máy giải trình tự tự động. - Căn cứ vào khả năng lên men tạo acid latic cao của 6 tỉnh, 6 dòng vi khuẩn đại diện cho 6 tỉnh của 3 vùng sinh thái đồng bằng sông Cửu Long: TA6, AG4, S3.11 1 , B3.2 1 n, K1.6 1 , TCM1.4 2 được chọn để giải trình tự.. - Sử dụng chương trình BLAST N để so sánh mức độ đồng hình của trình tự các dòng vi khuẩn phân lập với trình tự của dòng vi khuẩn trong ngân hàng gen trên trang NCBI BLAST.. - Hình 4: Mối quan hệ tiến hóa (cây phả hệ) của các dòng vi khuẩn lactic đã phân lập từ mẫu Cơm mẻ của ba vùng sinh thái ở đồng bằng sông Cửu Long. - Trong nhóm nhỏ 1 có 2 dòng TA6 và AG4 ở vùng sinh thái nước ngọt tạo thành một nhóm riêng biệt và tương đồng ở mức 99,94% so với các dòng còn lại. - Trong nhóm nhỏ 2 là các dòng còn lại của 2 vùng sinh thái nước mặn và lợ tạo thành một nhóm với mức tương đồng 99,99%. - Các dòng B3.2 1 n, S3.11 1. - S3.11 1 , K1.6 1 , TCM1.4 2 có mối quan hệ gần nhất với các dòng Lactocbacillus paracasei và Lactobacillus casei có mức tương đồngtừ 96 - 98% trên ngân hàng gen.. - Các dòng phân lập ở vùng nước mặn và nước lợ được thu mẫu ở những tỉnh giáp ranh nhau là Cà Mau, Kiên Giang, Bạc Liêu, Sóc Trăng. - Các mẫu cơm mẻ được làm từ nguồn nước ngầm, do khoảng cách địa lý gần nên nguồn gạo và cách làm cơm mẻ của người dân cũng không khác nhau nhiều dẫn đến các dòng vi khuẩn phân lập được có quan hệ gần nhau hơn. - Hai dòng TA6 và AG4 được phân lập ở Cần Thơ và An Giang có khoảng cách địa lý khá xa so với các mẫu còn lại. - Hai tỉnh này người dân chủ yếu sử dụng nguồn nước sông hoặc nước máy, cho nên điều kiện lên men của các mẫu cơm mẻ khác với vùng nước mặn và nước lợ dẫn đến có sự khác biệt về mặt di truyền của các loài vi khuẩn lactic.. - Lactobacillus casei, Lactocbacillus plantarum, Lactocbacillus paracasei là các dòng vi khuẩn được sử dụng phổ biến trong các chế phẩm probiotic vì nó có tác dụng ức chế lại nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, tăng khả năng hấp thu trong hệ tiêu hóa.. - Kết quả phân tích các thành phần cơ bản của 18 mẫu cơm mẻ thu được như sau:. - độ ẩm mẫu cơm mẻ dao động trong khoảng 71. - hàm lượng đạm trong cơm mẻ:. - Sáu mươi lăm dòng vi khuẩn acid lactic hầu hết đều có khuẩn lạc tròn, láng, màu sắc từ trắng đục đến trắng trong, hình que ngắn và dài, kết đôi hoặc kết chuỗi, không có khả năng chuyển động.. - Định danh được 6 dòng vi khuẩn lactic bao gồm AG.4 , TA6, S3.11 1 ,B3.2 1 n,TCM1.4 2 và K1.6 1. - Sử dụng các dòng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic cao để ứng dụng vào thực phẩm và thủy sản.