- KHẢO SÁT VÙNG GEN 16S rDNA CỦA MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM. - These materials were used to extract DNA and then amplify 16S rDNA region by the primer pair of 27F and 1495R.. - Keywords: Nitrogen fixing bacterium, 16S rDNA region, polymorphism, restriction enzyme, polymorphism index content. - Title: Study on 16S rDNA region of some nitrogen fixing bacteria isolated from paddy rhizosphere of Dong Thap province. - Mười sáu dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm được phân lập từ đất vùng rễ lúa được trồng tại bốn huyện thuộc Tỉnh Đồng Tháp là Lai Vung, Thanh Bình, Tam Nông và Tháp Mười (với 4 dòng ở mỗi Huyện) được phân tích vùng 16S rDNA bằng cặp mồi tổng 27F và 1495R, sản phẩm PCR được phân cắt bởi 4 enzyme cắt giới hạn (RE) là MspI, SmaI, EcoRI, HinfI. - Kết quả enzyme MspI có mức đa hình cao nhất với chỉ số PIC là 0,9238, EcoRI có tỷ lệ đa hình thấp nhất với chỉ số PIC là 0,6104. - Hai RE còn lại là HinfI và SmaI có chỉ số PIC lần lượt là 0,8298 và 0,7471. - Kết quả phân nhóm bằng phần mềm NTSYS PC-2.1 cho thấy 16 dòng vi khuẩn được chia thành 6 nhóm ở mức khác biệt khảo sát là 0,654%. - Các dòng vi khuẩn phân lập trong cùng một huyện cũng thể hiện sự khác biệt trên giản đồ phả hệ. - Bốn dòng phân lập từ huyện Lai Vung có mức độ khác biệt 1,87%, huyện Thanh Bình khác biệt ở mức 0,38%, huyện Tam Nông là 1,70% và Tháp Mười là 1,21%. - Tám dòng vi khuẩn thuộc nhóm đất phèn (huyện Tam Nông và huyện Tháp Mười) được phân thành 4 nhóm trong khi đó 8 dòng thuộc nhóm đất phù sa (huyện Thanh Bình và Lai Vung) phân bố trong 3 nhóm.. - Từ khóa: chỉ số PIC, enzyme cắt giới hạn, sự đa hình, vi khuẩn cố định đạm, vùng gen 16S rDNA. - Trong khi đó, vi khuẩn cố định nitơ sống tự do quanh vùng rễ lúa là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá. - Các nghiên cứu mới đây cho thấy nhóm vi khuẩn này cũng khá đa dạng chúng bao gồm nhiều chủng như: Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas, Beijerinskii, Clostridium, Herbaspirillum. - Vùng 16S rDNA từ lâu được biết như là thước đo về sự biến đổi trong hệ gen của các vi sinh vật. - Do có số lượng nucleotide lý tưởng (khoảng 1500 cặp nu) vùng gen này đã được nhiều nghiên cứu ứng dụng nhằm tìm ra sự khác biệt di truyền của các chủng vi sinh vật. - Những thông tin về sự khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn cố định đạm giúp các nhà khoa học có cơ sở để chọn lọc và phát triển những chế phẩm sinh học có hiệu quả cố định đạm cao ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp nói chung và trong sản xuất gạo nói riêng. - Nghiên cứu “Khảo sát vùng gen 16S rDNA các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm trên đất trồng lúa thuộc tỉnh Đồng Tháp” được thực hiện nhằm góp phần chọn lọc các dòng vi khuẩn bản địa để sản xuất phân sinh học phục vụ cho mục tiêu phát triển một nền nông nghiệp sạch và bền vững trong tương lai.. - Phân lập và khảo vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn a) Phân lập vi khuẩn. - b) Khảo sát vùng 16S rDNA Ly trích DNA. - (1989) cải tiến: Nuôi vi khuẩn trong 4 ml môi trường LB (Luria Broth) để thu sinh khối, cho 2 ml dung dịch vi khuẩn vào tuýp 2,2 ml, ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, thu cặn, hòa tan cặn với 250 l dung dịch TE (10 mM Tris + 1 mM EDTA, pH 8), thêm 50 l dung dịch 10% SDS và 10 l Proteinase K (10 mg/l), ủ 65 0 C trong 20 phút, mỗi 5 phút đảo ngược tuýp một lần để trộn đều dung dịch, thêm 400 l 10% CTAB/0,7 M NaCl, trộn đều, ủ ở 65 0 C trong 20 phút, thêm 600 l chloroform: isoamyl alcohol (24:1), trộn đều và ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút, dùng pipet chuyển cẩn thận phần trong phía trên vào tuýp mới và thêm 1 ml isopropanol, lắc đều, giữ ở –20 0 C ít nhất 30 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, giữ lại phần tủa, thêm 1 ml ethanol 70%, ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 5 phút, giữ phần tủa (làm 2 lần) mỗi lần đổ bỏ ethanol, sấy khô phần tủa trong máy sấy chân không ở 45 0 C trong 10 phút, hòa tan tủa trong 30 l nước cất 2 lần đã khử trùng, trữ ở -20 o C.. - Khuếch đại vùng gen 16S rDNA. - Vùng gen 16S rDNA được khuyếch bằng cặp mồi tổng 27F và 1495R có trình tự 27F: 5’ GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG 3’;1495R: 5’CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA 3’ (Weisberg et al., 1991). - Cắt vùng gen 16S rDNA bằng enzyme cắt giới hạn (RE). - Bốn RE sử dụng để cắt vùng gen 16S rDNA có trình tự nhận biết và nhiệt độ ủ như trong bảng 1, trong đó N là một nucleotide bất kỳ trong 4 loại A, T, G, C. - Phản ứng cắt được thực hiện trong thể tích 20 µl bao gồm 8 µl sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA, 1 µl RE (10 unit), 2 µl buffer (chuyên biệt cho từng enzyme) và 9 µl nước cất tiệt trùng. - Bảng 1: Các enzyme cắt giới hạn được sử dụng. - Sản phẩm cắt giới hạn được điện di trên agarose gel 2%, ở 60V trong 4 giờ chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000.. - Phân tích kết quả sản phẩm cắt với các enzyme cắt giới hạn. - Sau khi điện di kết quả phản ứng cắt với 4 enzyme cắt giới hạn, các band thu được trên bảng gel sẽ được tiến hành phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1. - Hàm lượng thông tin đa hình (Polymorphism information content = PIC) được xác định theo công thức:. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn. - Mười sáu dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ của 4 huyện thu mẫu, với 4 dòng ở mỗi huyện. - Các dòng vi khuẩn đều phát triển tốt trên môi trường không đạm Burk.. - 3.2 Khảo sát vùng 16S rDNA. - Khuếch đại vùng 16S rDNA bằng cặp mồi tổng 27F và 1495R. - Kết quả PCR 16 dòng vi khuẩn phân lập từ 4 huyện thuộc tỉnh Đồng Tháp thể hiện ở hình 1.. - Hình 1: Phổ điện di vùng 16S rDNA của các dòng vi khuẩn phân lập được. - M: thang chuẩn 100bp plus, 1-4 Mẫu vi khuẩn phân lập từ huyện Tháp Mười 5-8 Mẫu vi khuẩn phân lập từ huyện Lai Vung, 9-12 Mẫu vi khuẩn phân lập từ huyện Thanh Bình, 13-16 Mẫu vi khuẩn phân lập từ huyện Tam Nông. - Nhìn chung các mẫu PCR với cặp mồi tổng 27F và 1495R cho kết quả khá tốt các mẫu đều có band với kích thước khoảng 1468 bp. - 16S rDNA là vùng mã hóa các RNA ribosome được xác định là đoạn gen được bảo tồn nhất ở tất cả các tế bào.. - Trình tự các đoạn gen này ở các sinh vật có khoảng cách di truyền rất xa nhau vẫn tìm thấy có sự giống nhau. - Tuy nhiên, đây cũng là vùng rất linh họat, sự thay đổi trình tự các nucleotide ở vùng này được ứng dụng nhiều trong khảo sát di truyền các dòng vi khuẩn.. - (2009) sử dụng để khảo sát vùng 16S rDNA của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ nho (Vitis vinifera L. - (2004) sử dụng cặp mồi này khảo sát vùng 16S rDNA của họ vi khuẩn Azotobacteraceae gồm 7 loài thuộc chi Azotobacter và 3 loài thuộc chi Azomonas. - Kết quả của các nghiên cứu này đều tạo được sản phẩm PCR rõ với kích thước phù hợp khoảng 1460bp.. - Kết quả phân cắt với các RE thể hiện ở hình 2. - Tất cả 4 RE đều cho kết quả đa hình. - Theo bảng 2 và hình 2 enzyme MspI có tỷ lệ đa hình cao nhất với chỉ số PIC (Polymorphism information content) là 0,9238, tổng số phân đoạn (tổng band có kích thước khác nhau) là 12, tất cả các band đều có kích thước khác biệt, điều này làm cho enzyme MspI có phần trăm đa hình là 100%. - Tỷ lệ đa hình cao xếp ở vị trí kế tiếp thuộc về enzyme HinfI với chỉ số PIC là 0,8298, enzyme này tạo được 10 phân đoạn với 100% các phân đoạn tạo ra thể hiện đa hình. - Enzyme SmaI tạo được 5 phân đoạn với 80% các phân đoạn thể hiện đa hình, chỉ số PIC của enzyme này đạt 0,7471. - Tỷ lệ đa hình thấp nhất thuộc về enzyme EcoRI với chỉ số PIC là 0,6104, tổng số phân đoạn là 4 trong đó có 2 phân đoạn thể hiện sự đa hình hai phân đoạn còn lại gồm 1 không cắt và 1 là đơn hình. - Qua kết quả phân tích cho thấy MspI và HinfI là 2 enzyme có tỷ lệ đa hình và chỉ số PIC cao hơn 2 RE còn lại, điều này có thể là do vị trí nhận biết của các RE là không giống nhau. - MspI và HinfI tạo được sự khác biệt nhiều hơn do chúng có vị trí nhận biết là 4 cặp nu.. - Trong khi đó 2 RE còn lại là SmaI và EcoRI có vị trí nhận biết là 6 cặp nu (Bảng 1). - Tương tự đối với các RE có vị trí nhận biết là 6 cặp nu thì xác. - thước khoảng 1500 bp của đoạn gen 16S rDNA thì xác suất cắt của các RE có vị trí nhận biết là 4 cặp nu sẽ cao hơn so với các RE có vị trí nhận biết là 6 cặp nu.. - Bảng 2: Sự đa hình các đoạn 16S rDNA của 16 dòng vi khuẩn phân lập cắt bởi các enzyme cắt giới hạn. - Enzyme cắt Tổng số phân đoạn. - Số phân đoạn đa hình. - Chỉ số PIC. - Trung bình Nhằm khảo sát mối tương quan di truyền của 16 dòng vi khuẩn nghiên cứu, kết quả từ phản ứng cắt với 4 enzyme cắt giới hạn được chuyển qua hệ nhị phân để phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1.. - Kết quả (giản đồ phả hệ) hình 3 cho thấy, xét ở mức độ khác biệt 0,654% 16 dòng vi khuẩn khảo sát được chia thành 6 nhóm, trong đó nhóm III có tổng số dòng hiện diện cao nhất là 8 bao gồm: TN12, TM9, TB1, TB4, TB8, TM3, TM8, TB2 (Hình 3). - Ở mức độ khác biệt này, khảo sát sự phân nhóm của các dòng vi khuẩn theo địa điểm thu mẫu cho thấy, 4 dòng vi khuẩn phân lập từ huyện Lai Vung được chia là 2 nhóm (nhóm I và nhóm II) mỗi nhóm gồm 2 dòng với mức độ tương đồng của mỗi nhóm đạt 100%.. - Hình 2: Kết quả phân cắt vùng 16S với MspI, SmaI, EcoRI, HinfI 1-4 Mẫu LV . - So sách độ tương đồng của 2 nhóm cho thấy khác biệt ở mức 1,87%. - Trong khi đó bốn dòng vi khuẩn phân lập từ huyện Thanh Bình là TB1, TB2, TB4 và TB8 cùng phân bố trong nhóm III. - Khác biệt giữa 2 nhóm III 1 và III 2 thể hiện trên giản đồ ở mức 0,376%. - Bốn dòng thu thập từ huyện Tam Nông được chia thành 3 nhóm là nhóm III, V, VI, với 2 dòng TN2, TN5 ở nhóm VI đạt mức tương đồng 100%, nhóm III có 1 dòng là TN12, và nhóm V là dòng TN4, sự khác biệt của 4 dòng trên giản đồ là khoảng 1,682%. - Bốn dòng vi khuẩn phân lập từ huyện Tháp Mười được phân bố trong 2 nhóm là III và IV, trong đó nhóm III có 3 dòng là TM9, TM3 và TM8 với 2 dòng TM3 và TM8 có mức độ tương đồng đạt 100%. - Nhóm IV có duy nhất 1 dòng TM10 khác biệt với các dòng còn lại ở mức 1,212%.. - Hình 3: Giản đồ phả hệ 16 dòng vi khuẩn. - Cũng ở mức khác biệt 0,654%, hai huyện Tháp Mười và Tam Nông với 8 dòng vi khuẩn phân lập trên đất nhiễm phèn nặng (pH từ 3,5-4,5), được xếp trong 4 nhóm là III, IV, V, và VI. - Sự khác biệt của 8 dòng vi khuẩn thể hiện ở mức 1,682%.. - Trong khi đó 8 dòng phân lập từ 2 huyện là Lai Vung và Thanh Bình đại diện cho loại đất phù sa được phân bố trong 3 nhóm là I, II và III với mức khác biệt của 8 dòng ở mức 1,87%. - Khảo sát trên giản đồ cho thấy có sự khác biệt giữa 2 nhóm vi khuẩn thuộc 2 nhóm đất khác nhau với hệ số khác biệt là 1,87%. - Nhóm III được xem là trung gian khi có mặt cả dòng vi khuẩn phân lập từ đất phèn và dòng vi khuẩn phân lập ở đất phù sa với 4 dòng ở mỗi nhóm.. - 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận. - Kết quả phân tích đa dạng di truyền 16 dòng vi khuẩn từ 4 huyện với 4 enzyme cắt giới hạn là MspI, SmaI, EcoRI, HinfI cho thấy enzyme MspI có mức đa hình cao nhất với chỉ số PIC là 0,9238, EcoRI có tỷ lệ đa hình thấp nhất với chỉ số PIC là 0,6104. - Hai RE còn lại là HinfI và SmaI có chỉ số PIC lần lượt là 0,8298 và 0,7471.. - Ở mức độ khác biệt 0,654% 16 dòng vi khuẩn chia thành 6 nhóm. - Các dòng vi khuẩn có mức độ tương đồng 100% bao gồm LV20 và LV7. - Cũng ở mức độ khác biệt này, 4 dòng vi khuẩn phân lập từ huyện Lai Vung chia thành 2 nhóm với mức độ khác biệt là 1,87%. - Bốn dòng vi khuẩn phân lập từ huyện Thanh Bình cùng phân bố trong 1 nhóm khác biệt các dòng trong nhóm ở mức 0,376%. - Bốn dòng thu thập từ huyện Tam Nông được chia thành 3 nhóm sự khác biệt của 4 dòng là khoảng 1,682%. - Bốn dòng vi khuẩn phân lập từ huyện Tháp Mười được phân bố trong 2 nhóm khác biệt của các dòng ở mức 1,212%.. - Khảo sát sự phân bố của 16 dòng vi khuẩn theo 2 nhóm đất là phèn và phù sa ở mức khác biệt 0,654% cho thấy: 8 dòng phân lập từ đất phù sa được phân bố trong 3 nhóm là I, II, III. - 8 dòng phân lập từ đất phèn được phân bố trong 4 nhóm là III, IV V, VI. - Tiếp tục khảo sát sự đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn còn lại và 16 dòng đã khảo sát với nhiều enzyme cắt giới hạn hơn nhằm tăng độ tin cậy cho sự phân nhóm di truyền.. - Tiến hành kiểm tra hoạt tính cố định đạm của các dòng vi khuẩn để đưa vào ứng dụng thực tiễn.. - Endophytic bacterial diversity in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves described by 16S rDNA gene sequence analysis and length heterogeneity-PCR