- KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU Ở CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) BẰNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN GEN CHONDROITINASE. - Hàm lượng kháng thể được tạo ra khi ngâm cá với mật độ vi khuẩn đột biến gen CH là 2,1x10 8 CFU/mL cao hơn có ý nghĩa (p<0,05) so với các mật độ ngâm 2,1x10 7 và 2,1x10 6 CFU/mL và nghiệm thức đối chứng. - Hàm lượng kháng thể tạo ra khi ngâm cá với vi khuẩn đột biến trong 30 phút nhiều hơn so với ngâm 20 phút, 10 phút và nghiệm thức đối chứng. - Không có sự biến đổi cấu trúc ở gan và thận cá ở tất cả các nghiệm thức ngâm với vi khuẩn đột biến và nghiệm thức đối chứng trước khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn E. - ictaluri không đột biến.. - Trong đó bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi cá tra.. - Hiện nay, kỹ thuật gây đột biến gen đang được sử dụng khá phổ biến để tạo chủng vi khuẩn nhược độc có khả năng kích thích sinh kháng thể miễn dịch đặc hiệu mở ra hướng ứng dụng mới về vắc-xin trong nuôi thủy sản có thể sử dụng bằng phương pháp ngâm và cho ăn. - Trong nghiên cứu này, khả năng kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. - ictaluri trên cá tra bằng vi khuẩn E. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vi khuẩn gây cảm nhiễm. - Chủng vi khuẩn E. - ictaluri đột biến gen Chorontinase (CH) (do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III cung cấp). - Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường tryptone soya. - Trước khi tiến hành thí nghiệm, 10 con cá được chọn ngẫu nhiên để kiểm tra xác định cá không nhiễm ký sinh trùng và vi khuẩn.. - 2.3 Xác định LD 50 của chủng vi khuẩn E. - Thí nghiệm xác định LD 50 của chủng vi khuẩn E. - tiêm vi khuẩn với mật độ từ 10 3-7 CFU/mL. - Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan sát dấu hiệu bệnh mủ gan và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận và tỳ tạng. - Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD 50 ) được xác định theo công thức của Reed và Muench (1938).. - ictaluri đột biến gen CH bằng phương pháp ngâm. - ngâm với mật độ vi khuẩn từ 10 5-8 CFU/mL. - Cá được ngâm trong dung dịch vi khuẩn 30 phút sau đó bố trí ra các bể. - Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan sát dấu hiệu bệnh mủ gan và tái phân lập vi khuẩn từ thận.. - 2.5 Xác định nồng độ thích hợp ngâm vi khuẩn E. - ictaluri đột biến gen CH Thí nghiệm được bố trí với các nghiệm thức gồm có: (1) ngâm mật độ 2,1x10 8 CFU/mL. - Cá thí nghiệm được ngâm trong dung dịch vi khuẩn E. - Sau khi ngâm 2 tuần, cá được tiêm vi khuẩn chưa gây đột biến (liều LD 50 ) cho nghiệm thức thí nghiệm và nghiệm thức đối chứng. - Mẫu mô gan, thận, tỳ tạng và mẫu máu cá (khoảng 0,3 - 0,6 mL/cá) được thu hàng tuần sau khi ngâm để đánh giá tác động của vi khuẩn đột biến gen lên mô tế bào và đánh giá khả năng sinh kháng thể của cá. - 2.6 Xác định thời gian thích hợp ngâm vi khuẩn E. - ictaluri đột biến gen CH. - Cá thí nghiệm được ngâm với vi khuẩn E. - Sau khi ngâm 2 tuần, cá ở các nghiệm thức được tiêm vi khuẩn chưa gây đột biến (liều LD 50. - Hàng tuần sau khi ngâm, thu mẫu mô gan, thận, tỳ tạng cá để đánh giá tác động của vi khuẩn đột biến lên mô tế bào. - Thí nghiệm được tiến hành bằng cách ngâm cá tra khỏe với 4 nồng độ vi khuẩn mang gen đột biến CFU/mL). - Sau 14 ngày theo dõi, tất cả các nghiệm thức thí nghiệm đều không xuất hiện cá chết, độ an toàn khi ngâm vi khuẩn mang gen đột biến là 100%. - Vi khuẩn được xem như không có độc lực khi có giá trị LD 50 ≥ 10 8 CFU/mL (Esteve et al., 1993). - Kết quả trên chứng tỏ chủng vi khuẩn E. - 3.2 LD50 của chủng vi khuẩn E. - ictaluri không đột biến. - Cá ở thí nghiệm này được tiêm chủng vi khuẩn không đột biến với các nồng độ lần lượt từ CFU/mL. - 3.3 Xác định nồng độ ngâm vi khuẩn E. - Cá thí nghiệm được ngâm với 3 mật độ vi khuẩn đột biến gen CH là và 10 8 CFU/mL. - Ở nghiệm thức ngâm vi khuẩn đột biến gen CH với mật độ 10 7 CFU/mL và gây cảm nhiễm với vi khuẩn không đột biến (NT 3) cá chết với tỉ lệ là 55,6% đạt giá trị RPS là 16,6%. - Còn ở nghiệm thức ngâm vi khuẩn mang gen đột biến với mật độ 10 6 CFU/mL và gây cảm nhiễm với vi khuẩn không đột biến (NT 5) cá chết với tỉ lệ là 60%. - Trong khi đó cá ở các nghiệm thức đối chứng không ngâm vi khuẩn đột biến gen và gây cảm nhiễm với vi khuẩn không đột biến (NT 2, 4 và 6) cá chết với các tỉ lệ chết lần lượt là: 65. - khi ngâm với mật độ vi khuẩn đột biến là 10 8 CFU/mL thì cá được bảo hộ tốt hơn (39%) so với mật độ 10 7 CFU/mL. - Wise và Terhune (2001) thử nghiệm nhúng cá nheo Mỹ với vắc-xin RE-33 (vi khuẩn E. - ictaluri bất hoạt) ở 3 mật độ 2,5x10 5 , 2,5x 10 6 và 2,4x10 7 CFU/mL thì ở mật độ 2,4x 10 7 CFU/mL cho tỉ lệ sống 37,9% sau khi gây nhiễm với vi khuẩn E. - Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy RPS có giá trị là 39%, có thể do mật độ vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu thấp hơn (2,1x10 8 CFU/mL <. - Lê Hùng Dũng (2007) báo cáo rằng vắc-xin bất hoạt vi khuẩn E. - Phạm Công Thành (2010) khi tiêm nhắc vi khuẩn E. - Hình 1: Tỉ lệ cá chết sau cảm nhiễm ở thí nghiệm xác định nồng độ ngâm vi khuẩn đột biến. - Trong nghiên cứu này cá được ngâm với vi khuẩn đột biến một lần vào ngày thứ nhất sau đó gây cảm nhiễm vào ngày 14. - Mặc dù vậy, kết quả cho thấy vi khuẩn đột biến gen CH có khả năng kích thích miễn dịch đặc hiệu ở cá tra thể hiện qua hàm lượng kháng thể được tạo ra và chứng minh sự đề kháng của cơ thể khi cảm nhiễm vi khuẩn có độc lực thông qua hiệu giá kháng thể. - Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, cá trước khi ngâm vi khuẩn đột biến có hiệu giá kháng thể dao động từ . - Trong điều kiện thí nghiệm nguồn nước được đảm bảo không nhiễm vi khuẩn E. - ictaluri nhưng do cá thí nghiệm được nuôi trong ao sử dụng nguồn nước tự nhiên nên khó tránh sự tiếp xúc của cá với vi khuẩn trong nguồn nước. - Cho nên trước khi chuyển về phòng thí nghiệm cá có thể đã nhiễm vi khuẩn E. - Biểu đồ hình 2 cho thấy cá ở nghiệm thức 1 có hiệu giá kháng thể tăng vào tuần thứ 2 sau khi ngâm vi khuẩn đột biến gen CH khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với hiệu giá kháng thể của cá ở nghiệm thức 3, nghiệm thức 5 và nghiệm thức đối chứng.. - Hình 2: Biểu đồ hiệu giá kháng thể trung bình của thí nghiệm xác định nồng độ ngâm vi khuẩn đột biến gen. - Hiệu giá kháng thể ghi nhận từ thí nghiệm xác định nồng độ ngâm của chúng tôi có thể giải thích do trước đó cá đã tiếp xúc với vi khuẩn mang gen đột biến tạo được kháng thể nên khi gây cảm nhiễm tạo sự hình thành kháng thể thứ phát, đặc điểm của kháng thể thứ phát là luôn cao hơn nguyên phát và duy trì lâu hơn.. - Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Vinitnantharat và Plumb (1993) cho thấy những cá sống sót sau khi tiếp xúc với mầm bệnh có hàm lượng kháng thể cao và bảo vệ được cơ thể kháng lại vi khuẩn E. - Kết quả này cũng cho thấy mật độ 10 8 CFU/mL là thích hợp để ngâm vi khuẩn mang gen CH đột biến vì sau 1 tuần đã kích thích được hệ thống miễn dịch của cá tạo ra kháng thể chống lại vi khuẩn gây bệnh dù hàm lượng kháng thể tạo ra không nhiều và tỉ lệ bảo hộ không cao (39. - hiệu quả phòng bệnh do vi khuẩn E. - So với mật độ ngâm vi khuẩn đột biến là 10 8 CFU/mL thì hai mật độ ngâm 10 6 và 10 7 CFU/mL không kích thích được hệ miễn dịch của cá tra tạo ra nhiều kháng thể. - Nguyên nhân có thể do vi khuẩn chưa nhiễm hoặc đã nhiễm với mật độ không đủ mạnh để kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra kháng thể.. - 3.4 Xác định thời gian ngâm vi khuẩn E. - Thí nghiệm xác định thời gian ngâm vi khuẩn đột biến được bố trí cùng một mật độ ngâm (10 8 CFU/mL) với 3 thời gian ngâm là 30 phút, 20 phút, 10 phút và 3 nghiệm thức đối chứng không ngâm vi khuẩn đột biến (Hình 3).. - Hình 3: Tỉ lệ cá chết sau cảm nhiễm của thí nghiệm xác định thời gian ngâm vi khuẩn đột biến. - Biểu đồ hình 3 cho thấy cá ở nghiệm thức ngâm 30 phút với vi khuẩn đột biến gen và gây cảm nhiễm với vi khuẩn không đột biến (NT 1) có tỉ lệ cá chết thấp nhất (49.2%) đạt giá trị RPS là 29,5%. - Ở nghiệm thức ngâm 20 phút với vi khuẩn mang gen đột biến và gây cảm nhiễm với vi khuẩn không đột biến (NT 3) cá chết với tỉ lệ là 61,9% đạt giá trị RPS là 11,3%.. - Còn ở nghiệm thức ngâm 10 phút với vi khuẩn mang gen đột biến và gây cảm nhiễm với vi khuẩn không đột biến (NT 5) cá chết với tỉ lệ là 63,4% đạt giá trị RPS là (4,8. - Trong khi đó cá ở các nghiệm thức đối chứng không ngâm vi khuẩn mang gen đột biến và gây cảm nhiễm với vi khuẩn không đột biến (NT 2, 4 và 6) cá chết với các tỉ lệ chết lần lượt là: 60. - Như vậy, thời gian ngâm vi khuẩn mang gen đột biến ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập của. - vi khuẩn để kích thích cơ thể tạo ra kháng thể chống lại mầm bệnh. - Kết quả cũng chỉ ra rằng thời gian 30 phút là thích hợp hơn 10 và 20 phút để ngâm vi khuẩn mang gen đột biến với hệ số bảo hộ 29,5%. - Ở thí nghiệm này giá trị RPS của nghiệm thức ngâm cá vi khuẩn đột biến trong 30 phút là 29,5% nhỏ hơn giá trị RPS (39%) ở nghiệm thức tương tự của thí nghiệm xác định mật độ ngâm thích hợp.. - Ở thí nghiệm xác định mật độ thích hợp, cá được ngâm với mật độ vi khuẩn là 2,1x10 8 CFU/mL nhưng ở thí nghiệm thời gian mật độ là 0,6x10 8 CFU/mL.. - Hình 4: Hiệu giá kháng thể trung bình của thí nghiệm xác định thời gian ngâm vi khuẩn đột biến. - Vào tuần thứ 3, ở nghiệm thức ngâm 30 phút với vi khuẩn đột biến (NT 1) có hiệu giá kháng thể tăng và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) với nghiệm thức 3, 5 và nghiệm thức đối chứng (Hình 4). - (2009) ngâm vi khuẩn bất hoạt nồng độ từ 5,5x10 3-6 FU/mL với thời gian ngâm là 30 phút cho thấy vắc-xin có hiệu quả và phương pháp ngâm kết hợp cho ăn thì hiệu quả cao hơn.. - 3.5 Dấu hiệu bệnh lý của cá cảm nhiễm vi khuẩn E. - Cá cảm nhiễm vi khuẩn E. - 3.6.1 Biến đổi mô học của cá ngâm vi khuẩn E. - Cá ngâm với vi khuẩn đột biến không có sự biến đổi cấu trúc mô học ở 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng. - Điều này có thể giải thích khi vi khuẩn E. - Cả 3 nồng độ ngâm vi khuẩn E. - Hình 5: Dấu hiệu bệnh của cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E. - 3.6.2 Biến đổi mô học của cá cảm nhiễm vi khuẩn E. - Hình 6: Thận cá cảm nhiễm vi khuẩn E. - Mẫu cá được thu vào lúc ngâm vi khuẩn đột biến gen, cá chết sau gây cảm nhiễm 48 và 72 giờ và cá sống kể từ ngày thứ 8 sau khi gây cảm nhiễm để phát hiện vi khuẩn E. - Kết quả là tất cả các mẫu cá bệnh đều hiện vạch 407bp, cá trước khi gây cảm nhiễm (mẫu thận cá ở NT1, ngâm vi khuẩn đột biến 10 8 CFU/mL) cho kết quả dương tính chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn đột biến gen trong cơ thể cá nhưng không làm cá chết. - Ngâm cá tra với vi khuẩn E. - 0,52) sau khi ngâm vi khuẩn đột biến gen CH (mật độ 2,1x10 8 CFU/mL trong 30 phút) và tiếp tục tăng vào các tuần sau (tuần thứ ba đến tuần thứ 6). - Không có sự biến đổi cấu trúc của cá ngâm vi khuẩn E. - ictaluri đột biến gen CH nhưng có sự biến đổi cấu trúc ở gan và thận ở cá cảm nhiễm với vi khuẩn E. - Nghiên cứu này được thực hiện từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược độc dùng làm vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng kỹ thuật gây đột biến gen” thuộc chương trình Công nghệ Sinh học Ứng dụng trong Thuỷ sản do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tài trợ.. - Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chẩn đoán vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên thận cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). - Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý và thời điểm khác nhau của đồng bằng sông Cửu Long. - Khả năng đáp ứng miễn dịch của cá tra (Pangasius hypophthalmus) chống vi khuẩn Edwardsiella ictaluri